Chronic Fatigue Syndrome (CFS):
Celproliferatie en celsterfte van T-lymphocyten
-----------------------------------------------
Sofie van Impe
Verhandeling tot het behalen van de
wetteleijke graad van licentiaat in de biologische wetenschappen
Vrije Universiteit Brussel
Faculteit Wetenschappen Laboratorium Antropogenetica
Datum: 1998


Inhoudstabel
------------

I. Literatuurstudie
1 Definitie CFS
1.1 Inleiding
1.2 Symptomen
1.3 Benaming
1.4 Epidemiologie
Prevalentie
Prognose
1.5 Diagnostische criteria
Tabel 1.1 CDC-criteria
2 Etiologie/pathogenese
2.1 Inleiding
2.2 Hypothesen i.v.m de etiologie
a) Fysiologische hypothesen
b) Psychologische hypothesen
2.3 Virussen en micro-organismen als mogelijke oorzaak van CFS
2.3.1 Inleiding
2.3.2 Viruspersistentie
2.3.3 Virussen als mogelijke oorzaak van CFS
2.3.4 Besluit/samenvatting
2.4 Andere oorzaken?
Tabel I.3: Overzicht van virussen die mogelijk betrokken zijn in CFS
TabeI I.3: vervolg eerste deel
TabeI I.3: vervolg tweede deel
2.5 Enkele organische afwijkingen (Shepherd 1995)
A) STOORNISSEN IN BIOSYNTHETISCHE WEG
B) STOORNISSEN IN HET IMMUUNSYSTEEM
C) STRUTURELE EN FUNKTIONELE ANOMALIEN IN HET CENTRAAL ZENUWSTELSEL
D) NEUROFYSIOLOGISCHE EN NEUROPSYCHIATRISCHE AFWIJKINGEN (Shepherd, 1995)
2.6 Besluit (Shepherd, 1995)
3. Nieuw laagmolekulair RNase L in CFS (Suhadolnik, 1997)
4. Behandeling / diagnostiek
4.1 Behandeling van CFS : Algemeen
4.2 Recente ontwikkelingen in de behandeling van CFS
3. de celcyclus
3.1 De celcyclus: stadia van de celcyclus en zijn checkpoints
6. Het p53 gen
6.1 p53 algemeen : Inleiding
6.2 Struktuur van het p33 protein
6.3 P53, DNA schade en genetische stabiliteit
6.4 Ps3, de celcyclus, celproliferatie
6.4.1 Mechanisme van wildtype p53 bij inwerking op de celcyclus:
via p53 en rb (Levine, 1995)
6.4.2 Mutant p53 en de celcyclus
6.3 Enkele (virale en cellulaire) proteine partners van p53
(Soussi, 1995)
6.6 Besluit
7. Apoptosis
7.1 Inleiding
versus necrosis (celdood)
7.2.1 Definities
7.2.2 Verschillen op basis van morfologische kenmerken
7.3 Detektie van apoptosis
7.3.1 Morfologische en biochemische detektie
7.3.2 TUNEL (of TdT-mediated dUTP-biotin nick and labeling)
7.4 Apoptosis in T-lymfocyten algemeen
7.5 Apoptosls in lymfocyten van CFS-patienten
7.6 Apoptomis, autoimmune ziekten, kanker en andere ziekten
7.7 Besluit
8. Balans celproliferatie en apoptosis
Appendices
Appendix A : Cytokines (Reichlin, 1993)
Appendix B: 2-5A synthetase/RNase L biosynthetische weg
ALGEMEEN (review Shroder et al., 1992)
Appendix C Wat is moeheid ? (Inst Gczondheid Nederland)

II. DOELSTELLING
Doelstelling
III. MATERIAAL EN METHODEN
A. Algemene Inleiding
B. Werkschema [zie Tabel III.1]
C. Patienten en controles
1. Bloedstalen
2. Enquetelijsten
D. Cytochalasine -B geblokkeerde In vitro micronucleus-test
1. Principe van de cyto-B MN-test:
Algemeen
2. Het gebruik van de cyto-B MN-test in deze verhandeling
3. Protokol / Materiaal
3.1 BLOEDINZAMELING
3.2 LYMFOCYTENKULTUUR
3.3 Cyto-B GEBLOKREERDE MICRONUCLEUS TEST EN BEHANDELING MET MUTAGENEN
3.4 KLEURING
4. MICRONUCLEUS-TELLING (Tabel IV.2 en Bijlage 1)
5 Verwerking van de gegevens
5.1 PI, DI en % (Tabel IV.3 t.e.m. IV.24; IV.25a en b; IV.26a en b;
IV.27a en b)
5.2 Chi-kwadraat test algemeen
5.3 Chi-kwadraat voor kultuur A en B samenvoeging (Tabel IV. 28)
5.4 Chi-kwadraat (Tabel IV.29)=> synthesetabel (Tabel IV.30)
5.5 Vergelijking van parameter twee aan twee door regressie analyse
(Grafiek IV.1 tem IV.16)
1. Principe
1.1. Inleiding (Trauth en Keesey, Boehringer)
1.2. Toepassingen
1.3. Test Principe
2. Protokol / Materiaal
2.1 BLOEDINZAMELING (analoog met B.2)
2.2 LYMFOCYTENKULTUUR (analoog met B.2)
2.3 PROTOKOL preparaten-aanmaak: METAFASE-PREPARATEN
2.4 TUNEL-kit
2.5 Opmerking:
G-binding voor chromosoomaberratie-test
3. Tellingen
4. Verwerking van de gegevens : Chi-kwadraat-test
F. DNA-extractie (Qiamp Blood kit (250) cat n0 29106) (Qiagen)
G. RNA - extractie (RNeasy Total RNA kit(250) cat nO 74106) (Qiagen)
IV. RESULTATEN
A. Gegevens patienten en controles
3. Cytochalasine-D geblokkeerde in vitro micronucleus-test
1) Tellingen
2) Verwerkte gegevens
2.1) Percentages, proliferatie-index (P1) en divisie-Index (DI)
2.2) Samenvoegen van de overeenkomstige tellingen van kultuur A en kultuur B
2.3 Synthesetabel van signifikant verschillende parameters
2.4 Vergelijking van parameters twee aan twee door regressie analyse
a) CB versus o/oo Mono + MN
* Grafiek IV.1 (controle, -S9):
* Grafiek IV.2 (alcohol, -S9):
* Grafiek IV.3 (alcohol, +S9):
* Grafiek IV.4 (cyclo, +S9):
* Algemeen
* Grafiek IV.5 (controle,-S9):
* Grafiek IV.6 (alcohol, -S9):
* Grafiek IV.7 (alcohol, +S9):
* Grafiek IV.8 (cyclo):
C. Apoptosis-detektie
1) Tellingen
2) ChI-kwadraat verwerking
3) Beschrijving

V. DISCUSSIE

A. Vooropstellingen bij de proeven
3. Experimentele beperkingen
1. Cyto-3 geblokkeerde in vitro micronucleus-test
1.1 Populatiegrootte:
1.2 Staalnamne-afhankelijkheid
1.3 Analyse is niet altijd mogelijk
1.4 MMS concentratie
1.5 Bronnen van variatie
1.6 Achtergrond-informatie van patienten en controle-personen
2. Apoptosis-detektie
2.1 Besmette stalen
2.2 Onvolledige analyse
C. Bespreking van de resultaten
1. Cyto-B geblokkeerde in vitro micronucleus-test
1.1 Inleiding
1.2 Proliferatie
1.3 Spontane mutaties
1.4 Geinduceerde mutaties
1.5 MMS-resistentie
1.6 Besluit
2. Apoptosis-detektie
D. Besluit : Balans.
B. Toekomstperspektieven
Referenties


I. Literatuurstudie
-------------------
1. Definitie CFS
----------------

1.1 Inleiding
-------------

Chronic Fatigue Syndrome (chronisch vermoeidheidssyndroom), ook wel
Myalgische Encephalomyelitis ( ME ) genoemd, is een complexe aandoening
waarvan het voornaamste symptoom ten langdurige, onverklaarde, vaak
invaliderende vermoeidheid is. Het ziektebeeld gaat ook gepaard met andere
klachten. Een precieze definitie van het fenomeen geven is echter zeer
moeilijk, aangezien een objektief instrument dat chronische vermoeidheid kan
meten ontbreekt. De etiologie, pathogenese en behandeling staan nog steeds
ter discussie. Zelfs of hier sprake is van een ziekte-eenheid wordt
betwijfeld. Ondanks hot feit dat de World Health Organisation de ziekte
herkent en onderbrengt onder de neurologische aandoeningen (International
Classification of Diseases, nr 10, ref. 093.3), ondervinden patienten nog
steeds veel onbegrip en scepticisme. Dit is vooral te wijten aan het feit
dat er nog geen diagnostische test bestaat voor de ziekte. Op dit moment
gaat het dus steeds om een werkhypothese en deze is vooral gebaseerd op het
uitsluiten van andere aandoeningen.

1.2 Symptomen
-------------

CFS wordt vooral getypeerd door een ernstige algemene vermoeidheid,
spiervermoeidheid en myalgieen, die langer dan zes maanden aanwezig zijn.
De mentale en fysieke capaciteit worden soms in ernstige mate aangetast.
Het syndroom wordt ook frequent gekarakteriseerd door lichte koorts,
hoofdpijn, pijnlijke lymfeknopen en neuropsychiatrische symptomen. In vele
gevallen zijn er ook aanwijzingen voor een virale betrokkenheid bij de
aanvang van de ziekte.

1.3 Benaming
------------

De naam Myalgic Encephalomyelitis werd voor het eerst gebruikt in een
hoofdartikel in 'The Lancet' toen men een post-infectieus syndroom beschreef
dat in Noord West-London voorkwam en dat een jaar later het personeel van
het Royal Free Hospital in dezelfde stad trof. De term 'post-viral fatigue
syndrome' (PVFS) is synoniem geworden aan 'Myalgic Encephalomyelitis'.
In de Verenigde Staten worden de benamingen 'chronic fatigue (and) immune
dysfunction syndrome ( CFIDDS )' en 'chronic fatigue syndrome with
encephalopathy' gebruikt om eenzelfde symptomencomplex te beschrijven.
Sommige geneesheren verkiezen de term 'chronic fatigue syndrome' (CFS).1
(Shepherd et al., 1995) Men vindt nog een wijde varieteit aan andere
benamingen, waaronder chronic Epstein-Barr virus syndrome, Akureyri disease,
chronic mononucleosis, Iceland disease, neuromyasthenia, postviral fatigue
syndrome, Royal free disease, yuppie flu, low natural killer syndrome,
enz.


1 ] In deze tekst zal echter steeds de term CFS gebruikt worden


'Chronic fatigue syndrome' is de naam die gebruikt werd voor het syndroom in
1988 door de medische research gemeenschap. Men verkiest deze naam vermits
het niets suggereert over de oorzaak van de ziekte, terwijl het belangrijkste
symptoom toch benadrukt wordt. 'Post-viral fatigue syndrome (of in Australie,
'Post-viral syndrome') suggereert een virale oorzaak of trigger. 'Myalgic
Endephalomyelitis' (ME) betekent myalgieen (spierpijnen) plus inflammatie
van de hersenen en zenuwen (encephalomyelitis). Terwijl myalgieen veel
voorkomen in het syndroom is inflammatie van de hersenen en de zenuwen
eerder zeldzaam of zelfs niet aanwezig.

Chronic fatigue syndrome als naam voor de ziekte geeft veel ongenoegen aan
mensen met CFS, vermits het de ziekte trivialiseert. Het is equivalent met
het noemen van diabetes 'chronic thirst syndrome'. Ondanks het feit dat de
naam het hoofdsymptoom benadrukt, geeft het niet de ernst van de ziekte
weer.

In Groot Brittanie,Belgie en Canada, houden de patientenhulpgroepen het op
ME;. In de USA verkiezen ze CFIDS ('Chronic fatigue and immune dysfunction
syndrome') noemen.

1.4 Epidemiologie
-----------------

Prevalentie
-----------

Hoewel men niet over exacte gegevens beschikt wordt verondersteld dat een
niet onaardig percentage van de volwassen bevolking 'Chronic fatigue' heeft.
Bij veel van deze patienten is dit een gevolg van een primaire
psychiatrische aandoening, zoals depressie, chronische angsttoestanden, al
dan niet gepaard gaande met hyperventilatie, en zullen we een beeld vinden
dat analoog is aan CFS depressie => inactiviteit => deconditionering =>
'ziek' zijn . Zowat een kwart van deze groep (Shepherd el al., 1995 ) heeft
een onderliggende organische oorzaak als basis voor de vermoeidheid. Bij nog
anderen zal er eerder een interaktie zijn onder de vorm van een combinatie
van psychologische, lichamelijke en sociale faktoren.

Vele bruikbare cijfer-gegevens omtrent de prevalentie bestaan er niet,
vandaar dat er een dringende behoefte is aan grootschalige epidemiologische
studies. Ondertussen tonen gegevens bekomen uit een aantal kleinere studies
aan ( Dowsett et al., 1990; Lloyd, 1990; Ho-Yen en McNamara, 1991 ;Hinds en
McCluskey, 1993; * 1995) dat wat betreffende ME/CFIDS:

- de prevalentie rond 0.3-2.7 / 1000 ligt (de reden van deze grote
spreiding zijn waarschijnlijk de verschillende definities die
worden gebruikt)
- de piek incidentie in de leeftijdsgroep tussen 20-40 jaar ligt
- het kan voorkomen bij kinderen vanaf de leeftijd van 7 jaar
- er een licht overwicht van voorkomen is bij vrouwen
- het voorkomt in alle socio-economische groepen; maw meer in
het onderwijs en in medische/ paramedische beroepen

In een recente enquete waaraan huisartsen in Nederland deelnamen werd een
prevalentie van 1.3 per 1000 berekend. Bazelmans, Vercoulen, Swanink et
al., 1996)

De pick leeftijd bij de aanvang ligt voor beide geslachten bij de mid-
dertigers, met een smallere piek tussen 15 en 20 jaar bij vrouwen alleen.
Vrouwen van alle leeftijden zijn ernstiger aangetast dan mannen, en de
vrouw/man ratio van 3:1 in het acute stadium stijgt tot 9:1 na 10 jaar
ziekte. CFS is zeldzaam onder de leeftijd van 15 jaar ( < 10% van het
totaal ) en minder frequent na 45 jaar ( 20% van het totaal ).
(Ramsay, 1992)

Prognose
--------

CFS is een ziekte met een hoge morbiditeit en een lage mortaliteit. Volledig
herstel is zichtbaar in eenderde van de patienten, vooral jonge mensen. Na
18 maanden aandoening herstelt 12 % (Buchwald, 1994).

1.5 Diagnostische criteria
----------------------------

Bij het klinisch definieren van deze conditie is het hoofdsymptoom ernstige
vermoeidheid. Daarnaast wordt het getypeerd door een abrupt begin, meestal
getriggered door een virale infectie [zie deel 2.3] . Bij het verdere
verloop van de ziekte werden reeds verscheidene,- veel voorkomende,
virus-aanwezigheden vastgesteld. Deze virussen, die het syndroom misschien
onderhouden, zijn niet per se dezelfde als de oorspronkelijke en komen ook
niet altijd tot uiting onder de vorm van een infektie [zie 2.3.2]. Andere
opvallende niet-specifieke kenmerken zijn myalgieen en cognitieve
disfuncties (stemmings- en slaapstoornissen en een verlaging van het korte-
termijn-geheugen en de concentratie). Dit alles moet aanhouden voor minimum
zes maanden, eventueel met fluctuaties in de ernst van de symptomen, opdat
men zou kunnen spreken van C(hronic)FS. (Holmes et al., 1988; Sharpe et
al., 1991; Fukuda et al., 1994) Er werden diagnostische criteria opgesteld,
enerzijds om onderscheid te kunnen maken tussen CFS en andere aanverwante
aandoeningen; anderzijds om conforme richtlijnen te stellen voor
onderzoeksdoeleinden. Verschillende landen hanteren echter verschillende
criteria, wat soms leidt tot onduidelijke situaties, veel verwarring en soms
tegenstrijdige resultaten en uiteraard de onmogelijkheid om resultaten te
vergelijken. In artikels houdt men zich echter meestal bij de Amerikaanse
CDC-criteria (= Centres for Disease Control, Atlanta ] [ zie tabel 1.1 ]
(Holmes et al., 1988 ; Fukuda et al, 1994).


Tabel 1.1
CDC-criteria
------------

(1) Klinisch geevalueerde, onverklaarbare, aanhoudende of terugkerende
chronische vermoeidheid die plots begonnen is; deze is niet het
resultaat van voortdurende constante uitputting; verbetert niet bij
rust; en waardoor het vroegere niveau van arbeids-, school-, sociale
of persoonlijke aktiviteiten aanzienlijk verminderen; en

(2) de aanwezigheid van vier of meer van de volgende symptomen, welke
moeten aanwezig zijn gedurende 6 maanden van de ziekte en die het
ontstaan van de vermoeidheid niet hebben voorafgegaan:

- zelfwaargenomen vermindering van het korte termijn geheugen of
concentratie in die mate dat ze aanleiding geven tot een
substantiele vermindering in de arbeids- schoolse-, sociale of
persoonlijke aktiviteiten
- keelpijn
- gevoelige lymfeklieren
- spierpijn
- hoofdpijn nieuw type, veranderd patroon of ernst
- niet-herstellende slaap
- malaise na inspanning die meer dan 24 uur duurt
- pijn in meerdere gewrichten zonder zwelling of roodheid


De overige criteria, nl. Oxford criteria (Sharpe d a?., 1991), Australische
criteria (Lloyd et al., 1988), ... baseren zich naast een opsomming van
symptomen, ook op het feit dat men andere medische en psychiatrische
aandoeningen moet uitsluiten. Dit is tevens wat men bij de diagnose tot op
heden vooral aanwendt, aangezien er nog steeds geen routine diagnostische
tests bestaan om CFS op te sporen.

2. Etiologie / pathogenese
--------------------------

2.1 Inleiding
-------------

De faktoren die een rol spelen in de ontwikkeling van de klachten zijn voor
het merendeel nog steeds niet gekend. In de literatuur werden een aantal
hypothesen (zowel omtrent somatische ale psychologische faktoren )
voorgesteld die een rol zouden kunnen spelen in de ontwikkeling en
bestendiging van CFS [zie 2.2].

In een groot deel van de gevallen lijken de klachten te zijn gestart volgend
op een acute infectie-ziekte. Een aantal micro-organismen werden reeds naar
voor gebracht als mogelijke oorzaak van het syndroom [zie 2.3]. Tot dusver,
blijkt geen enkele van deze organismen verantwoordelijk te zijn. (Ablashi,
1994; Levy, 1994)

Dit resulteert in de hypothese dat er een persistente virus-infectie samen
met een abnormale reactie van het immuunsysteem plaatsvindt (Straus, 1988).

Bovendien worden voor een aantal geselekteerde groepen patienten een aantal
abnormaliteiten van de spieren gevonden. Dit zou kunnen betekenen dat deze
klachten een organisch substraat hebben [zie verder]

2.2 Hypothesen I.v.m. de etiologie
----------------------------------

a] Fysiologische hypothesen
---------------------------

Een aantal somatische en psychologische hypothesen werden reeds voorgesteld
als de oorzaak van CFS (Shafran, 1991 ;Klonoff 1988). Vermits vele van deze
gevallen volgden op een acute koortsachtige ziekte, is 1 van de hypothesen
dat CFS het resultaat is van een persistente infectie welke leidt tot een
continue immuun aktivatie met de produktie van inflammatorische cytokines.
(Komaroff, 1988a; Josepha et al, 1991; Yousef et al., 1988; Defreitas,
1991).

Vele organismen worden reeds gelinkt aan dit syndroom en de lijst groeit nog
steeds. Tot hier toe is er echter nog geen bewijs voor een verantwoordelijk
agens gevonden (Levy, 1994; Heneine et al., 1994; Ablashi, 1994), ondermeer
doordat de proeven niet altijd herhaalbaar zijn. Dit is misschien te wijten
aan het feit dat er verschillende groepen patienten werden gekozen en dat
deze verschillende subgroepen kunnen voorstellen.

Wat betreft de virale theorieen, i.v.m. de oorzaak van CFS, werden reeds
verschillende principes gepostuleerd (Hyde, 1992a). Zij zijn als volgt:

1) Single enterovirus: een van de volgende virussen kunnen CFS
veroorzaken: poliovirus, coxsackie virus en ECHO virussen.
2) Multiple enterovirus: 1 of alle bovenstaande virussen kunnen
CFS veroorzaken
3) Precursor + enterovirus: een initiele immuun verwonding (injury)
vindt plaats, welke van tijdelijke of chronische aard kan zijn.
Deze wordt gevolgd door de causale infectie met een enterovirus.
Deze initiele immuun verwonding kan te wijten zijn aan een
verschillende of dezelfde groep van virussen of kan ook het
gevolg zijn van een niet-virale immuun verwonding.
4) Single herpesuirus: 1 van de volgende herpesvirussen kan CFS
veroorzaken : EBV (Epstein-Barr virus), cytomegalovirus, HHV-6,
Varicella-zoster virus, Inoue-Melnick virus
5) Multiple herpesvirus: alle of 1 herpesvirus kan CFS veroorzaken
6) retrovirus : een retrovirus, in aktie gelijkend maar toch
verschillend met het AIDS-virus en HTLV virussen, kan CFS
veroorzaken
7) Common precursor retrovirus: een common precursor van AIDS en
CFS bestaat. Dit kan geassocieerd worden met HHV-6 of een ander
nog niet gekend virus of virus-achtig partikel.

De derde theorie (precursor + entorovirus) is een van de meest populaire.
De Nightingale Research Foundation, een autoriteit op CFS/ME gebied,
aanvaard dit ook als werkhypothese. Doch ook op de andere hypothesen wordt
veel research verricht.

Het lijkt redelijk om zich af te vragen of de gastheer-respons tegen deze
antigenen niet verstoord is, aldus resulterend in chronische symptomen.
Studies van humorale en cellulaire immuniteit onthullen subtiele
immunologische disfuncties (Caligiuri et al., 1987; Gin et al., 1989;
Lloyd et aL, 1989; Landay et al., 1991; Barker et al., 1994). Sommige van
deze parameters weerspiegelen een beschadigde functie, terwijl anderen een
hyperaktiviteit suggereren. Doch, deze immunologische bevindingen verklaren
niet de volledige symptomatologie van CFS; ook correleren ze niet met het
feit dat de symptomen kunnen veranderen met de tijd.

Vermits 1 van de uitgesproken symptomen van CFS myalgieen zijn, worden er
reeds vele studies verricht i.v.m. spier-metabolisme, physiologie en
histopathologie (Arnold et al., 1984; Archard et al., 1988; Edwards et al,
1991a; Behan et al., 1985; Behan et al., 1991; Wesseley et all, 1989;
Stokes et al., 1988; Riley et al., 1990; Sisto, 1996). Ondanks het feit dat
er een breed spectrum aan histopathologische veranderingen in spierbiopsies
van CFS-patienten worden beschreven, zijn deze niet consistent met elkaar,
kunnen zo ook voorkomen in gezonde individuen, of kunnen zo het resultaat
zijn van secundaire veranderingen te wijten aan fysische inaktiviteit.
De resultaten van de mentale training-testen zijn compatibel met fysische
deconditionering (Stokes et al., 1988; Riley et al., 1990).

b) Psychologische hypothesen
----------------------------

Psychologische faktoren kunnen een rol spelen in de ontwikkeling van de
symptomen, of ten minste in de bestendiging van de symptomen, d.m.v. een
complexe interaktie met somatische faktoren. Drie hypothesen werden
voorgesteld i.v.m. de mogelijke rol van psychologische faktoren in het
onderhouden van de klachten. (Vercoulen et al., 1991)

(1) Vermijden van fysische activiteit ('the inactivity hypothesis')
---------------------------------------------------------------------

Hierbij wordt verondersteld dat de patient na infektie inaktief blijft.
Als een consequentie zal zijn fysische conditie erop achteruitgaan. Aldus
zullen klachten zoals vermoeidheid en myalgieen voorkomen op een lagere
niveau van zware inspanning. De patient zal trachten deze klachten te
omzeilen door fysische inspanningen te vermijden. Door dit alles komt de
patient terecht in een viscieuze cirkel.

(2) Depressie
---------------

Patienten met CFS hebben veelal een verhoogde score op depressie-enquetes
(Straus, 1988). Deze verhoogde depressie-scores kunnen echter ook gevonden
worden bij patienten met chronische fysische klachten. Waardoor men kan
besluiten dat de depressie het resultaat kan zijn van CFS (Abbey et al.,
1991; Ray, 1991).

Depressie kan ook een rol spelen in het onderhouden van de klachten. Er werd
immers reeds aangetoond dat patienten met verhoogde depressie-scores een
vertraagde herstelperiode van de infectie kunnen vertonen. Het mechanisme
van deze interaktie is nog steeds niet volledig begrepen, maar het is
duidelijk dat het een interaktie is tussen somatische en psychologische
faktoren. Faktoren zoals depressie en stress kunnen invloed hebben op het
immuunsysteem en aldus het individu meer kwetsbaar maken voor een infectie
(Stein et al., 1985; Cohen et al., 1991; Kendell, 1991 ). Depressie kan
leiden tot immunologische en endocriene afwijkingen, terwijl depressieve
patienten ook een merkbare fysische inaktiviteit vertonen, welke de
'inactivity hypothesis' ondersteunt.

(3) somatische oorzaak
------------------------

Patienten met CFS hebben de neiging om hun klachten toe te schrijven aan
somatische oorzaken. Ze zijn ervan overtuigd dat de klachten een fysische
oorzaak hebben en te vertonen vaak een sterke weerstand tegen een
psychologische interpretatie van de klachten ( Wesseley et al., 1989;
Hickie et al., 1990a; Manu et al., 1989; Vercoulen et al., 1994). Doch,
doordat de oorzaak niet gevonden wordt, wordt een sfeer van hulpeloosheid
gecreerd en dit kan leiden tot het vermijden van fysische oefeningen, of
kan depressieve gevoelens veroorzaken. Dit betekent dat een depressie
onbehandeld blijft en dus een onderhoudende (of bestendigende) invloed kan
hebben op de klachten.

Het is duidelijk dat, wat betreft depressie verbonden met CFS, het
waarschijnlijk een complexe combinatie zal zijn tussen zowel somatische als
psychologische processen.


2.3 Virussen en micro-organismen als mogelijke oorzaak wan CVS
----------------------------------------------------------------

2.3.1 Inleiding
---------------

In de loop der jaren werden een aantal micro-organismen beschouwd als de
mogelijke oorzakelijke faktor van CFS [Zie Tabel I.2]. De referenties in
deze tabel verwijzen echter naar studies van varierende kwaliteit en met
soms tegenstrijdige resultaten. De patienten-groepen zijn ook meestal
slecht gedefinieerd en dus moeilijk onderling vergelijkbaar.

Tabel 1.2
----------

Mogelijke oorzakelijke agentia van CFS
--------------------------------------

naam type
---------------------------------------------------
Epstein-Barr virus (1982) Herpesvirus
varicella zoster virus (1984) Herpesvirus
cytomegalovirus (1984) Herpesvirus
human herpesvirus type 6 (1988) Herpesvirus
enterovirussen (1988) Picornaviridae
retrovirussen (1991) Retroviridae
Borella burydorferi (1987) Spirochetes
Toxoplasma gondii (1985) Protozoa
Candida albicans (1989) Fungi
--------------------------------------------------


2.3.2 Viruspersistentie
-----------------------

Onder persistentie van virussen verstaat men dat de virale produkten zoals
RNA en virale eiwitten in weefsels worden aangetroffen zonder dat infectieus
virus kan worden aangetoond. Over persistentie van enterovirussen is nog
weinig bekend, evenmin over de faktoren die hiertoe zouden kunnen leiden.
Virussen in het algemeen kunnen op een zeer uiteenlopende wijze persisteren
in hun gastheer. Een voorwaarde daarbij blijkt te zijn dat de geinfecteerde
cel niet onmiddellijk ten gronde gaat. Sommige virussen bereiken dit door in
de vorm van DNA te persisteren (Herpesvirussen, HIV). Andere voorkomen
lysis door een 'celvriendeijke' replicatie-cyclus, soms doordat defekte
virusmutanten ontstaan (Southern et al., 1986). Verdere voorwaarden hierbij
zijn het ontbreken van een doelmatige immunologische herkenning en
eliminatie van de geinfekteerde cellen (Ahmed et al., 1990).

2.3.3 Virussen als mogelijke oorzaak van CFS
--------------------------------------------

Hierna wordt in tabelvorm [Zie Tabel 1.3] een overzicht gegeven van de
virussen die mogelijk betrokken zij in CFS en worden de studies vermeld die
verricht werden omtrent dit onderwerp. Ook de belangrijkste ziektebeelden,
naast CFS, die geassocieerd worden met een bepaald virus worden aangehaald.
Verder wordt bij de herpesvirussen vernoemd dat het virus persisteert en
welk type lymfocyt het infekteert.

2.3.4 Besluit / samenvatting
----------------------------

Een welgefundeerde en bewezen associatie van een der bovenstaande organismen
(zowel virussen als fungi, protozoa en spirochetes) met CFS is nog steeds
niet bewezen; noch in het onderhouden, noch in het veroorzaken ervan. Wel
valt het groot aantal studies naar het breed spektrum van organismen, als
mogelijke oorzaak of bestendiging van CFS, op.

2.4 Andere oorzaken?
--------------------

Naast de oorzaken van microbiologische aard werd ook reeds gedacht aan andere
typen. Zoals de invloed van intoxicatie door orgaanfosfaat-pesticiden
(Carrigan et al., 1991; Dunstan, 1995; Dunstan, 1996). Op basis hiervan
wordt zelfs getracht een diagnostische test op te stellen (McGregor, 1996a
en 1996b, Carpman, 1996). Ook de invloed van amalgaam bij CFS stond ter
discussie. Doch, er bestaat geen bewijs dat het verwijderen van amalgaam van
de tanden een therapeutisch effect heeft (Michel et al., 1989). Velen van
de patienten denken dat ze leiden aan hypoglycaemia. Een studie gaf echter
aan dat zij tijdens symptomatische perioden een normaal bloed-glucose niveau
vertoonden (Palardy et al., 1989). Aan de invloed van vaccinaties werd ook
gedacht (oa hepatitis) (Shepherd, 1995). De associatie van CFS met allergien
komt ook voor (Jones en Straus, 1987). De gelijkenis met het 'Gulf War
Syndrome' wordt ook gemeld. Dit syndroom zou het gevolg zijn van intoxicatie
door oorlogsgifgassen (Kenneth CH, et al. 1996; Fiedler N et al. 1996;
Josepha SC et al, 1997).

2.5 Enkele organische afwijkingen (Shepherd, 1995)
--------------------------------------------------

Verschillende studies werden reeds gedaan op mogelijke organische afwijkingen
bij CFS, waaronder:

A) stoornissen in biosynthetische wegen
B) stoornissen in het immuunsysteem (abnormale immuunrespons)
C) structurele en funktionele anomalieen in het centraal zenuwstelsel
D) neurofysiologische en neuropsychiatrische afwijkingen
E) neurotransmitter anomalien
F) spierpathologie
G) hypothalame-hypofysaire-as afwijkingen

De meest opvallende worden hierna besproken:


A) STOORNISSEN IN BIOSYNTHETISCHE WEG
-------------------------------------

- Geaktiveerde 2-5A synthetase / RNase L biosynthetische weg:

Deze biosynthetische weg is betrokken in de dubbelstrengig RNA afhankelijke
antivirale respons en maakt deel uit van het antiviraal mechanisme van
interferon (review Schroder et al., 1992) [zie ook Appendix B]. CFS is een
aandoening die gekarakteriseerd wordt door een geaktiveerde
2-5A synthetase/RNase L biosynthetische weg (Suhadolnik et al., 1994a). Dit
betekent dat in PMBC (periferale bloed mononucleaire cellen) van
CFS-patienten een lager gemiddeld niveau van latent 2-5A synthetase, een
hoger niveau van bio-aktief 2-5A, een hoger niveau van RNase L aktiviteit,
en een hoger gemiddeld niveau van geaktiveerd 2-5A synthetase gedetekteerd
werden, i.v.g.l.m. gezonde controle-personen. Modulatie van deze
biosynthetische weg door Ampligen (mismatched'dsRNA) en een geassocieerde
klinische verbetering van CFS werden gemeld [zie 4.2].

Volgens Suhadolnik (et al., 1994) is de geaktiveerde status, van de 2-5A
synthetase/RNase L biosynthetische weg in CFS en de respons op Ampligen
consistent met een geaktiveerde immuun status en een rol voor persistente
virale infectie in de pathogenese van CFS. Immers, een permanent verhoogd
niveau van lymfokinen kan het antigen-gedreven systeem uitputten, wat dan
zou kunnen leiden tot de symptomen van CFS.

B) STOORNISSEN IN HET IMMUUNSYSTEEM
-----------------------------------

B) STOORNISSEN IN HET IMMUUNSYSTEEM
-----------------------------------

- Verhoogde antilichamen tegen virale proteinen (van EBV en andere
   herpesvirussen) (Jones et al., 1985; Straus et al., 1985; Holmes et
   al., 1987; Tobi et al., 1982)
- Lage of afwezige antilichamen tegen EDNA of ESNA- 1 (van EBV)
   (Straus, 1985; Miller et al., 1987)
- Partiele hypogammaglobulinemia ( vooral wat betreft milde IgM
   deficienties) (Straus et al., 1985)
- Verhoogde suppressie van immunoglobuline synthese in vitro (Tosato
   et al., 1985]
- Verhoogde aantallen circulerende immuuncomplexen (Straus et al.,
   1985) : eenvierde tot eenderde van de patienten vertoont dit, doch
   de niveaus zijn nog steeds onder die typisch geassocieerd met
   immuun complex-gemedieerde afwijkingen.
- Verhoogde immunoglobuline release in vitro door mitogen-
   gestimuleerde lymfocyten (Borysiewicz et al., 1986)
- Immuunaktivatie (Landay et al., 1991)
- Verhoogde gehalten serum angiotensin-converting enzyme (ACE) bij
   80% van de CFS patienten vergeleken met 9,4% bij controles
   (Lieberman en Bell, 1993). Verhoogde ACE-aktiviteit wordt ook
   frequent waargenomen bij sarcoidose, een andere ziekte waarbij een
   hyperaktief immuunsysteem aanwezig is.
- Verhoogde gehalten van cytokines : als reactie op een continue
   antigene stimulatie (Cheney et al., 1989; Ho-Yen et al., 1988;
   Lever et al, 1988; Lloyd et al., 1991; McDonald et al., 1987;
   Straus et al., 1989; Chao et al.,1991) [Zie ook Appendix A: Cytokines]
- lgG subclass deficienties en normale IgG levels (Read et al., 1988;
   Linde et al.., 1988 ; Komaroff et al., 1988)
- Verhoogde leukocyten 2',5'-oligoadenylaat synthetase : men vond CFS-
   patienten die normale (lage of niet detecteerbare) levels van
   circulerende interferon vertoonden, maar paradoxaal hadden zij ook
   een statistisch significante stijging van 2',5'-aligoadenylaat
   synthetase aktiviteit (Straus et al., 1985; Ho-Yen et al., 1988;
   Lloyd et al., 1988; Lever et al., 1988; Morte et al., 1988).
   Dit enzyme wordt geinduceerd door IFN tijdens acute virale
   infecties [zie ook Appendix B en 2.5.A].
-  Verlaagde immune (gamma) interferon synthese in vitro door mitogen-
   gestimuleerde lymfocyten : Kibler identificeerde ook een reduktie in
   in vitro synthese van immune interferon bij gekultiveerde lymfocyten
   van 13 CFS-patienten (Kibler et al., 1985).
- Verlaagde interleukine-2 synthese in vitro door mnitogen-gestimuleerde
   lymfocyten: Kibler et al. identificeerde significante reducties in
   in vitro synthese van interleukine-2 bij gekultiveerde lymfocyten van
   13 patienten met CFS. (Kibler et al., 1985). Maar in een andere studie
   werden verhoogde IL-2 concentraties gezien (Cheney et al., 1989). En
   in nog een andere studie werden normale IL-2 concentraties opgetekend
   (Straus et al., 1989)
- Verhoogde helper / suppressor ratio (Straus et al., 1985)
- Verhoogde T-cel differentiatie (Straus et al., 1993)
- Verlaagde cytotoxische NK cell aktiviteit in de studie van Kibler
   (Kibler et al., 1985) was de NK cel aktiviteit deficient; een
   bevinding die geconfirmeerd werd door twee onafhankelijke groepen
   (Straus, 1988; Caligiuri el al., 1987 -> het aantal NK cellen in
   CFS patienten was normaal of zelfs een beetje verhoogd, maar hun
   functie is duidelijk verlaagd). En ook bij anderen (Ho-Yen et al.,
   1991a; Lusso et al., 1993; Morrison el at, 1991; Tirelli et al.,
   1993; Tirelli et al., 1994).
- Verlaagde EBV-specifieke cytotoxische T cell aktiviteit (Kibler et
   al., 1985)
- Bewijzen van verstoorde cellulair immuniteit In vitro verlaagde
   lymfocytenproliferatie als reactie op mitogene stimulatie (Behan et
   al., 1985; Klimas et al., 1990; Lloyd et al., 1989, Straus, 1993)


BESLUIT:
--------

Een aantal punten dienen aangehaald te worden:

- Hoewel er geen bewijs is, wijzen de beschikbare data in de richting van
   een abnormale gastheer reactie tegen bepaalde persisterende micro-
   organismen als een faktor voor de ontwikkeling van CFS (Swanink,
   review).
- Een verhoogde cytokine produktie zou mogelijk de vermoeidheid en de
   algemene malaise kunnen verklaren [zie ook Appendix A]
- De magnitudes en de types van immunologische abnormaliteiten lijken
   niet te correleren met de ernst van de symptomen.
- De hierboven beschreven anomalien vormen niet noodzakelijk een
   bewijs voor een verstoord immuunsysteem en de patienten ontwikkelen
   geen opportunistische infecties als gevolg ervan. (Shepherd, 1995)
- De gecombineerde literatuur betreffende immunologische antwoorden
   van patienten met CFS is er 1 die onvoldoende is en het ontbreekt
   aan consistente en reproduceerbare bevindingen.

De gepubliceerde bevindingen spreken elkaar dus dikwijls tegen; misschien is
dat te wijten aan het feit dat de patienten niet allemaal even erg aangetast
waren of zich in een ander stadium van hun ziekte bevonden. Andere
variabelen zoals leeftijd, geslacht en stress of infecties kunnen eveneens
het immuunsysteem beinvloeden. Ook de mogelijkheid van het bestaan van
verschillende subtypen is reel. (Shepherd, 1995).


C) STRUTURELE EN FUNKTIONELE ANOMALIEN IN HET CENTRAAL ZENUWSTELSEL
-------------------------------------------------------------------

- Magnetische resonantie van de hersenen suggereren dat sommige patienten
   een organisch probleem hebben dat zich manifesteert op neuro-imaging.
   (Shepherd, 1995).

- A.d.h.v Spect scans kan men onderscheid maken tussen CFS en depressie.
   In een andere studie kwam men tot het besluit dat de waargenomen
   abnormaliteiten te wijten konden zijn aan een chronische virale
   encefalitis. Spect scans abnormaliteiten zouden ook nuttig kunnen zijn
   om de klinische progressie van de ziekte te volgen. (Shepherd, 1995)


D) NEUROFYSIOLOGISCHE  EN NEUROPSYCHIATRISCHE AFWIJKINGEN (Shepherd, 1995)
--------------------------------------------------------------------------

- Cognitieve functies: zowel MS (Multiple Sclerosis) als CFS patienten
   ervaren dezelfde moeilijkheden wat betreft gelijktijdig verwerken van
   complexe cognitieve functies. Cognitieve moeilijkheden kunnen in direkt
   verband staan met specifieke immunologische anomalien.
- Psychiatrische morbiditeit : de depressie ervaring in dit syndroom is
   verschillend van deze gezien bij psychiatrische patienten en staat in
   nauw verband met de ernst van de symptomen.
- Slaapstoornissen slaapanomalien en een veralgemeende vermindering in
   slaapefficientie werden teruggevonden bij vele patienten.


2.6 Besluit (Shepherd, 1995)
----------------------------

Zoals gezegd werden in de literatuur verschillende hypothesen voorgesteld,
zowel met betrekking tot somatische als psychologische faktoren. Tot hiertoe
werden reeds vele studies verricht omtrent de mogelijke interaktie van
CFS met micro-organismen, doch bewijzen voor deze betrokkenheid zijn er nog
niet. Ook voor andere faktoren, buiten de betrokkenheid van micro-organismen,
werden geen doorslaggevende bewijzen gegeven wat betreft de oorzaak van CFS.

Doch, ondanks alles, heeft men toch vermoedens omtrent de etiologie van CFS.
Welke van de onderzoeksbevindingen, die besproken werden, werkelijk relevant
zijn en hoe het verband moet gezien worden met symptomatologie is tot nu toe
onduidelijk. Toch ontwikkelt zich stilaan een hypothese die rekening houdt
met de faktoren die de ziekte voorafgaan en onderhouden:

Voorafgaande faktoren omvatten een aantal veel voorkomende virale infecties
[2.3], tezamen met andere agentia, waaronder vaccinaties en neurotoxines
[2.4], dewelke een grote belasting betekenen voor het normale immuunsysteem.
Co-faktoren bij het ontstaan kunnen overdreven fysieke of mentale stress
inhouden tezamen met de mogelijkheid van hormonale en genetische invloeden.

Wat dan het syndroom onderhoudt is veeleer speculatief. Bovenstaande
hypothese bekijkt de mogelijkheid van een complexe interactie tussen
persisterende en/of gereactiveerde virale infecties [2,3], stoornissen in
het immuunsysyteem [3.B] en hieruit volgende anomalien in de hersen- en
spierfunktie. Het gegeven dat een persisterende virale infektie kan
interfereren met een aantal sleutelfunkties zonder duidelijke
celbeschadiging te veroorzaken wordt besebreven door Oldstone (1989).

Toch kunnen virussen en andere faktoren blijkbaar een uitlokkende faktor
vormen in het ontstaan van CFS en daarna van geen enkele betekenis meer zijn
in de pathologie (Shepherd, 1995). Het voornaamste effekt kan zijn dat ze
een permanente stoornis in de hypothalame-hypofysaire-as veroorzaken [3.D].
Deze theorie wordt ondersteund door de bevindingen van matige
hypercortisolemie [3.D] en een aktivering van de 5HT1 receptoren [3.D]. Ook
kunnen stoornissen in de produktie van cortisol de serotonerge en
noradrenerge neurotransmitter-systemen in de hersenen beinvloeden, welke
beide een hoge concentratie aan steroide-receptoren bezitten.

3. Nieuw laagmolekulair RNase L in CFS (Suhadolnik, 1997)
---------------------------------------------------------

Uit een heel recente studie van Suhadolnik (et al., 1997) blijkt dat de
deregulatie van de 2-5A synthetase/Rnase L biosynthetische weg veel verder
gaat dan enkel de aktivering ervan [zie ook deel 2.5.A]. Zij vonden immers
bewijzen voor de aanwezigheid in lymfocytenpellets van een nieuwe vorm van
het RNase L, met een lager molekulair gewicht. Dit, mogelijk defektief,
enzyme zou een verklaring kunnen geven voor observaties bij CFS zoals de
onmogelijkheid tot het controleren van veel voorkomende virussen (zoals EBV
en HHV-6).

De resultaten van de studie tonen ook aan dat de aanwezigheid van het nieuw
verkorte enzyme en de afwezigheid van normale enzymen gerelateerd zijn met
de ernst van de CFS-symptomen. Immers, alle CFS patienten bezaten het nieuwe
verkorte enzyme, maar sommigen bezaten ook het normale enzyme terwijl de
meest ernstige geinvaildeerde personen enkel het nieuwe, laagmolekulair
enzyme bezaten. Vermits het nieuwe enzyme niet voorkomt in gezonde personen
zou het potentieel de basis kunnen vormen van een diagnostische
laboratarium-test voor CFS. De researchers speculeren dat het tevens een
objektieve indikator zou kunnen zijn voor de ernst van de ziekte.

4. Behandeling / diagnostiek
----------------------------

De slecht gedefinieerde etiologie van deze ziekte heeft ertoe bijgedragen
dat een effectieve algemene behandeling nog steeds niet voorhanden is. De
behandeling gebeurt dus meestal puur symptomatisch. Vermits men de
somatische oorzaak nog niet kent, bestaat er nog geen diagnostische test om
de ziekte op te sporen. Komt daarbij nog dat vermoeidheid op zich moeilijk
te meten is [zie appendix C]. Hierdoor is de diagnostiek tot op heden vooral
beperkt tot het uitsluiten van andere aandoeningen en het volgen van de
diagnostische criteria [zie ook 1.5]. Nieuwe hoop is echter gericht op de
studie van Suhadolnik (et al., 1997), waarbij een nieuw RNase L gevonden
werd bij CFS, die mogelijk zou kunnen gebruikt worden als een biologische
merker [zie ook 3].

4.1 Behandeling van CFS : Algemeen
----------------------------------

Op dit ogenblik bestaat dus geen consensus over de waarde van verscheidene
geneesmiddelen, supplementen en psychologische therapieen. Bijgevolg worden
op het moment een groot aantal behandelingen toegepast. Er werden resultaten
gepubliceerd van verschillende therapieen, doch bij de meeste van deze
studies waren de patientenaantallen te klein om een degelijke conclusie te
geven. Bij drie van deze studies werden positieve effecten gerapporteerd
hoge dosissen 'evening primerose all', magnesiumsulfaatinjecties en
immunoglobulines. Geen enkele verbetering werd gemeld bij gebruik van
acyclovir (inhibeert replicatie Herpesvirus) of Vitamine B 12.
(Shepherd, 1995)

4.2 Recente ontwikkelingen in de behandeling van CFS
----------------------------------------------------

Ampligen-toediening bij de behandeling van CFS lijkt hoopvol. Ampligen
(poly(I).poly(C12U)) is een specifieke vorm van 'mismatched' dsRNA., met een
antivirale en immunomodulatorische werking. Er werden klinische verbeteringen
op lange termijn waargenomen van CFS-patienten na behandeling met Ampligen
(Suhadolnik et al., 1993; Suhadolnik et al., 1994a en 1994b; Strayer et
al., 1994; Strayer et al., 1995)

Ampligen is een allosterische 'modifier' van 2-5A synthetase, d.w.z. dat de
concentratie aan Ampligen de 2-5A synthetase/RNase L biosynthetische weg kan
beinvloeden. Therapie met Ampligen resulteert in een negatieve regulatie van
deze 2-5A synthetase/Rnase L biosynthetische weg bij CFS. Dit wil zeggen een
daling in bio-aktief 2-5A en RNase L aktivitcit, en een daling in 2-5A
synthetase [zie ook deel I.2.5.A] (Suhadolnik et al, 1994a en 1994b).

Suhadolnik (et al. 1994) meldt een daling in HHV-6 aktiviteit na toediening
van Ampligen. Er werd eveneens een reductie van 'giant cell formation'
vastgesteld na Ampligen behandeling. 'Giant cell formation' in dit systeem
is geassocieerd met HHV-6 infektie. Of HHV-6-expressie en/of 'giant cell
formation' evenwel een rol spelen in de CFS symptomatologie is niet bekend
[zie 2.3] (Strayer et al., 1995). Doch, recente studies geven aan dat
Ampligen de in vitro replicatie van HHV-6 kan inhiberen (Ablashi et
al., 1994).

De aktivering van 2-5A synthetase [zoals vermeld in deel 2.5.A] kan het
resultaat zijn van een chronische overstimulatie te wijten aan een
chronische virale reaktivatie. Suhadolnik (et al., 1994) geeft dan ook als
reden voor het herstel na Ampligen een direkte inhibitie van virale
reaktivatie of een mogelijke herstelling van de lymfokine balans.

3. de celcyclus
---------------

3.1   De celcyclus: stadia van de celcyclus en zijn checkpoints
---------------------------------------------------------------

De celcyclus is een opeenvolging van gebeurtenissen waarin de periodische
replicatie van DNA en de gelijke segregatie van dit gerepliceerd DNA tot
dochtercellen plaatsvindt. De celcyclus wordt ingedeeld in vier perioden,
nl. G1-, G2-, S- en de M-fase. Tijdens de S- of synthesefase wordt het DNA
gedupliceerd; tijdens de M- of mitosefase scheiden de gecondenseerde
chromatiden. G1 en G2 zijn de 'gaps' tussen respektievelijk M en S en S
en M. (Levine, 1995) [zie tek. 1.1].

Hoe verloopt de celcyclus nu ? Tijdens de GL-fase accumuleren cyclines, die
gegroepeerd zijn in een aantal categorien, voorgesteld door letters. De
cyclines reguleren cyclin dependent kinases of cdk's. Er bestaan
verschillende cdk's, aangeduid door nummers. De samenwerking van de
cyclines met de cdk's resulteert in de fosforylatie van een aantal
belangrijke proteinen.

GO: deze fase is een soort van rust stadium waarin cellen kunnen
terechtkomen, meestal in vroege G1. Eens in deze fase, cycleren de cellen
niet meer, maar via stimulatie kunnen ze opnieuw de G1 fase ingaan.

De proliferatieve celcyclus heeft een serie van regulatorische checkpoints.
Deze checkpoints moeten doorlopen worden opdat de cel volledig doorheen de
celcyclus zou gaan en aldus tot celdivisie zou overgaan. Indien de cel
geblokkeerd is door de controle aan een checkpoint dan gebeurt een celcyclus
'arrest', gevolgd door herstelling van de schade (repair) en herintrede in
de celcyclus. Indien de cel niet in staat is om de schade te herstellen
ondergaat ze apoptosis.

Via een scric van checkpoints kan de cel dus gemonitord worden om te
controleren of alles juist functioneert en progresseert. De cel is in staat
om DNA schade te ontdekken als die voorkomt, of te zien of het cycleren van
proteinen onderbroken werd. Ook de nutritionele omstandigheden van het
medium, de massa van de cel en andere noodzakelijke faktoren worden getest.

6. Het p53 gen
--------------

6.1   p53 algemeen : Inleiding
------------------------------

Het menselijk p53 gen ligt op de p-arm van chromosoom 17 (17p13.1) en is
ongeveer 20 kilabasen lang. Het bestaat uit 11 exonen, waarvan exon 5 tot
8 in de evolutie het best geconserveerd zijn. Het p53 gen codeert voor een
fosfoproteine van 53000 dalton en 393 aminozuren. Het eiwit kan in een
zure, hydrofobe en basische regio opgedeeld worden.

p53 is een transcriptiefaktor en bindt met een specifieke sekwentie van
33 bp op het DNA. Puntmutaties, zowel in de specifieke sekwentie als in het
gehele gen, leiden tot het verlies van de bindingscapaciteit op deze zone,
zodat p53 niet meer als transcriptiefaktor kan fungeren. (Deboeck, 1996)

Het p53 gen is een tumor suppressor gen. Dit is een gen waarvan zijn
aktivatie, expressie of introductie resulteert in de suppressie of inhibitie
van een tumorogeen fenotype. (Franks en Teich, 1991) De stappen van de
celcyclus kunnen door verscheidene factoren gereguleerd worden, zowel
negatief als positief. p53 is een proteine dat belangrijk is als een
negatieve regulator van de celcyclus. (Levine et al., 1991)

Het p53 produkt wordt ook gevonden als complex met de tumor-antigenen van
verschillende oncogene virussen. Wijziging in het gen (door mutatie) dat
leidt tot complete afwezigheid van het p53 produkt of de verschijning van
een gewijzigd produkt blijkt het meest geobserveerde fenotype te zijn in
humane kankers (by. small cell lung carcinoma, mammary carcinomas in humans,
leukemies van muis en mens, etc.) (Franks en Teich, 1991)(Levine AJ
et al., 1991).

6.2   Struktuur van het p33 protein
-----------------------------------

Het p53 proteine kan opgedeeld worden in drie regio's. (1) Het amino-einde
bevat het transcriptionele transaktivator domein. Dit is uiterst stabiel,
vermits de globale struktuur belangrijker is dan de sekwentie; hierdoor is
het zeer resistent tegen inaktivatie door een enkele mutatie. Het amino-
uiteinde is de bindingesite van een groot aantal virale en cellulaire
proteinen (o.a. Elb van adenovirus 5, MDM2, RPA, TBP). Er zijn eveneens
sites aanwezig voor fosforylatie door DNA-afhankelijke kinasen. (2) Het
carboxy-einde bevat de drie nucleaire lokalisatie signalen (NLS's) en het
deel nodig voor p53-oligomerisatie (formatie van tetrameren). Ook
?Negatieve regulatie?(Hainaut?). Dit carboxy-einde is de target van
verschillende cellulaire en virale proteinen, doch, in tegenstelling met
proteinen die het amino-einde binden, is nog geen biologische functie
toegeschreven aan deze interakties. (3) De centrale regio bevat sekwentie-
specifieke DNA-bindingsdomein. In deze regio komen veel mutaties voor.
(Soussie, 1995). Het bevat ook herkenningssites voor o.a. SV4OT antigen en
het papillomavirus E6 proteine.

6.3   Ps3, DNA schade en genetische stabiliteit
-----------------------------------------------

In 1984 rapporteerden Malzman en Ozyzyk dat UV straling van muiscellen
stabilisatie van het p53 proteine in vivo induceerde. Deze resultaten werden
herhaald door Kastan et al. (1991) (review door Soussie, 1995) die met
gamma straling een gelijkaardig fenomeen observeerden. Deze auteurs toonden
eveneens an dat p53 protein accumulatie een transiente blockage van de
celcyclus bij de G1 fase, net voor DNA replicatie, induceerde (Kastan et
al., 1991; Kuerbitz et al., 1992). Het wordt algemeen aangenomen dat deze
blockage van celdivisie volgend op DNA-schade de cel de tijd geeft om een
SOS response te induceren om de lesies te herstellen (repair). De meest
interessante vondst in dit domein is dat dit fenomeen afwezig is in cellen
die een mutant p53 uitdrukken, t.t.z. deze cellen ondergaan geen groei stop
(arrest) na DNA-schade. Transfektie van wild-type p53 in cellen die
functioneel p53 ontbreken herstelt de G1 arrest volgend op irradiatie.
Fritsche (et al., 1993) toonde aan dat dit fenomeen zich niet beperkt tot
UV of gamma irradiatie, maar ook geldt voor elk type van DNA lesie.

Bovenstaande studies leidden tot het voorstel dat p53 helpt om de genetische
integriteit van de cel te behouden (Lane, 1992). p53 zou daarvoor werken als
een soort van 'stoplicht', dat een arrest van de celcyclus zou induceren
zodat de cel de tijd krijgt om de DNA schade te herstellen (repair). Indien,
voor nog ongekende redenen, de cel niet in staat is om de schade te
herstellen, is het denkbaar dat p53 celdood zou induceren via apoptosis.

Tumorcellen die een mutant p53 bevatten zijn niet langer in staat om hun
genetische integriteit te behouden vermits ze niet langer een groei stop
signaal ontvangen, resulterend in een cel wiens genoom minder stabiel is en
welke verschillende mutaties zal accumuleren, aldus het ontstaan veroorzaken
van clonen met een grotere malignancy. (Soussie, 1995)

6.4 Ps3, de celcyclus, celproliferatie
--------------------------------------

6.4.1 Mechanisme van wildtype p53 bij inwerking op de celcyclus:
       via p21 en rb (Levine, 1995)
----------------------------------------------------------------

Een van deze eiwitten, die door cdk's gefosforyleerd worden, is rb, een
tumor suppressor gen dat retinoblastoma kan veroorzaken. Gefosforyleerde rb
veroorzaakt een gecontroleerde overgang van G1 naar S. Dus, de normale rol
van rb in de celcyclus is de negatieve regulatie van de G1/S transitie
[zie Tek 1.3] Het gehalte van een ander tumor suppressor gen, p53, is laag
in normale cellen met onbeschadigd DNA. Het p53 genprodukt zorgt ervoor dat
een ander eiwit, p21, gesynthetiseerd wordt. In normale cellen met
beschadigd DNA is er veel p53 aanwezig en wordt p21 in overvloed gevormd.
p21 blokkeert de fasforylatie van rb, omdat p21 bindt op de cdk's, met als
resultaat dat er geen G1/S-transitie mogelijk is. Dit geeft de cel de tijd
om de DNA-schade te herstellen, alvorens replicatie en mitotische segregatie
te starten. [zie Tek I.4] Men kan dus zeggen dat p53, net als rb, een
negatieve regulator van de celcyclus is.

Uit recent onderzoek blijkt dat wildtype p53 ook een rol zou spelen in de
controle van G2-block (Paules et al., 1995), de overgang van G2 naar M; en
dus de getrouwheid van de chromosomale segregatie (Guillouf et al, 1995,
Stewart et al., 1995). Hiervoor werd echter nog geen afdoend bewijs
gevonden. Men kan dus stellen dat wildtype 053 waakt over de integriteit van
de cel door controle van G1/s- en mogelijk G2/M-checkpoints en door inductie
van apoptosis. Hieruit blijkt het belang van p53 voor de cel.

6.4.2 Mutant p53 en de celcyclus
--------------------------------

Mutatie ter hoogte van p53 heeft gevolgen voor de regulatie van de celcyclus.
Wanneer in een kankercel, waar het p53 gen gemuteerd is, DNA schade optreedt,
zal het mutant p53 dat gesynthetiseerd wordt ervoor zorgen dat er geen
G1-arrest optreedt. Dit komt doordat p21, die op de cdk's bindt en die
fasforylatie van rb en G1/S-transitie veroorzaakt, niet aangemaakt wordt.
De celcyclus wordt dus niet gestopt als antwoord op de DNA-schade. Hierdoor
zal ten duplicatie van de DNA-schade optreden, waardoor letale mutaties en
bijgevolg celdood of amplificatie van oncogenen en bijgevolg een agressieve
kanker kan optreden.

6.3   Enkele (virale en cellulaire) proteine partners van p53
       (Soussi, 1995)
-------------------------------------------------------------

Niet minder dan 17 virale of cellulaire proteinen die aan p53 kunnen binden
werden beschreven [zie Tabel 1.4]. Zij bezitten de capaciteit om te
interageren met het p53. De virale proteinen gaan met deze interaktie het
p53 inaktiveren. Het virus moet immers kunnen overleven in de cel die het
geinfekteerd heeft. DNA tumor virussen vereisen dat hun gastheercellen delen
om de virusmultiplicatie te optimaliseren. Daarom hebben verschillende
virussen een gelijkaardig strategie ontwikkeld. Het betreft de inaktivatie
van twee proteinen die betrokken zijn in de negatieve regulatie van de
celgroei : de produkten van de retinoblastoma (rb) en de p53 genen (Levine
en Momand, 1990).

In het geval van SV40 is het AgT dat bindt met p53 (op het carboxy-
einde) en rb (aan het amino-einde). In het geval van het adenovirus type 5,
bindt het virale E1b proteine specifiek met p53 en inhibeert de
transactivationele aktiviteit, het virale B1A protein sequestert het rb
proteine. Bij de menselijke papillomavirussen (HPV's), kan het E6 proteine
van HPV16 en HPV18 een degradatie van het p53 induceren, terwijl het
E7 proteine specifiek bindt met het rb proteine (Scheffner et al., 1990).
De interaktie van p53 met het hepatitis B virus (HBV) HBx proteine of het
Epstein-Barr virus (EBV) Epstein-Barr nucleair antigen 5 (EBNA5) zijn nog
niet voldoende bestudeerd om een analoog mechanisme voor te stellen.

6.6 Besluit
-----------

De checkpoints van de cellulaire transities G1/5, S/G2,G2/M en M/A staan
allemaal onder controle van p53. Dit suppressorgen kan onder invloed van
DNA schade, hypoxia en/of oncogene aktivatie de cel blokkeren in een van de
transities om herstel toe te laten of geprogrammeerde celddood (apoptasis)
te induceren. (Jacks en Weinberg, 1996] Maar indien p53 defekt is, ontstaan
problemen met de regulatie van apoptosis en celproliferatie.

7. Apoptosis
------------

7.1 Inleiding
-------------

De term apoptosis werd geintroduceerd door Wyllie (et al., 1972) om een
celdood-fenomeen te benoemen dat zij als pathologen in levercoupes
geidentificeerd hadden. Er bestaan twee verschillende vormen van celdood:
apoptosis en necrosis. Geprogrammeerde celdood of apoptosis is de meest
voorkomende vorm van eukaryotische celdood. Het is een fysiologisch
zelfmoordmechanisme dat homeostase (celpopulatie constant houden) bewaard,
waarbij celdood gebeurt op een natuurlijke wijze tijdens de normale
weefsel-turn-over. Apoptasis is ook essentieel in vele fysiologische
processen, o.a. maturatie en effektor mechanismen van het immuunsysteem,
embryonale ontwikkeling van weefsel, organen en ledematen, ontwikkeling van
het zenuwstelsel. (Trauth en Keesey, Boehringer; Duke et al., 1996)
Verkeerde regulatie van apoptosis kan een rol spelen in vele pathologische
condities. Dit kan o.a het geval zijn bij kanker, vermits apoptosis helpt om
de progressie naar kanker te stoppen. In de oncologie is er veel interesse
in apoptosis. Dit komt vanwege de observatie dat deze vorm van celdood
getriggerd wordt door een aantal antitumor drugs, radiatie en hyperthermia.
De interesse vloeit ook verder uit het feit dat de intrinsieke eigenschap
van tumorcellen om te reageren via apoptasis gemoduleerd is door expressie
van verscheidene oncogenen. Dit zou dus een prognostische merker kunnen zijn
voor kanker behandeling. (Trauth en Keesey, Boehringher) Over het algemeen
vertonen cellen die apoptosis ondergaan een karakteristiek patroon van
strukturele veranderingen in de nucleus en het cytoplasma, o.a. snelle
blaasvorming van de plasma-membraan en nucleaire desintegratie. De nucleaire
collaps is geassocieerd met enorme schade aan het chromatine en DNA-cleavage
in oligonucleosamale-lengte fragmenten, na aktivatie van een calcium-
afhankelijk endogeen endonuclease.

7.2 Apoptosis versus necrosis (celdood)
---------------------------------------

(Duke et al., 1996; Corcoran et al.; 1994; Trauth en Keesey, Boehringer,
1994)

7.2.1 Definities
----------------

Celdood kan gedefinieerd worden als de 'status waarbij cellen totaal
incapabel zijn tot gelijk welke functie'. Celdood kan voorkomen via twee
verschillende mechanismen, necrosis en apoptosis. (Gerschenson et al., 1994)

Necrosis of pathologische/toxische celdood (Kerr et al., 1972) gebeurt enkel
wanneer een cel ernstig gewond is door blootstelling aan extreme variaties
van fysiologische condities zoals bijvoorbeeld hypoxia, hyperthermia, ea.
Apoptosis of 'geprogrammeerde celdood' (Kerr et al., 1972) gebeurt meestal
onder normale fysiologische omstandigheden, waarbij de cel een aktieve rol
speelt in zijn eigen ondergang ('cellulaire zelfmoord') (Boehringer). Deze
vorm van celdood is essentieel bij normale cel-turnover en weefselhomeostase,
inductie en behoud van de immuuntoleranties en ontwikkeling van het
zenuwetelsel.

Apoptosis werd op basis van morfalogie herkend als een manier van celdood
die voorkomt zowel onder bepaalde pathologische omstandigheden (by. virale
hepatitis) als onder fysiologische condities. In tegenstelling, necrosis
komt nooit voor onder fysiologische condities en is typisch een gevolg van
een ernstige schade. (Corcaran, 1994)

7.2.2 Verschillen op basis van morfologische kenmerken
------------------------------------------------------

Pathalogen onderscheidden oorspronkelijk apoptasis van necrosis op basis van
morfologische kenmerken (Kerr et al., 1972; Searle et al., 1982; Wylie and
Duvall, 1992).

In het geval van necrosis zwelt de cel op, interne organellen (zoals de
nytochondria) zwellen op en scheuren, de cel barst uit elkaar en verliest
zijn inhoud. Dit gebeurt omdat schade de cel belet om zijn membraan-
homeostase te controleren : water en extracdilulaire ionen (vooral natrium
en calcium ionen), die normaal uit de cel worden gepompt, stromen de cel
binnen. Meestal gaan cellen dan massaal ten gronde, wat resulteert in een
inflammatie circulerende macrofagen en andere witte bloedcellen van het
immuunsysteem komen samen op de necrotische cellen en verteren ze.
[zie Tek 1.6]

Bij apoptosis verliest de cel door vormverandering het contact met zijn buren.
Hij wordt ook aanzienlijk kleiner, maar de meeste celorganellen blijven
grotendeels intakt en de celmembraan is niet doorlaatbaar. Het chromatine
(DNA en geassocieerde proteinen) in de celkern condenseert volgens
karakteristieke halve maantjes langs de kernmembraan. Op dit punt worden de
apoptotische cellen meestal verteerd door buurcellen (incl. scavenger cells).
Stervende cellen die niet geconsumeerd worden ondergaan verdere veranderingen.
Op het oppervlak van de cel verschijnt blaasvorming en uiteindeijk valt de
cel uiteen in fragmenten, die apaptotische lichaampjes (apoptatotic bodies)
worden genoemd. Deze vesikels bevatten intakte mitochondrien, ribosomen en
stukken nuclcair materiaal. De fragmenten worden opgenomen door naburige
cellen en macrofagen, om verteerd te worden (Ceuppens, 1996; Duke et al,
1996). Het hele proces verloopt doorgaans zeer snel en er lekt bijna niets
uit de cellen of celfragmenten, zodoende is er ook geen ontstekings-
reaktie.[Zie Tek 1.6]

7.3 Detektie van apoptosis
--------------------------

7.3.1 Morfologische en biochemische detektie
--------------------------------------------

Verscheiden methoden zijn reeds beschreven om apoptotische cellen te
identificeren (Trauth en Keesey, Boehringer). Apoptotische cellen kunnen op
basis van morfologische kenmerken gedetekteerd worden. Endonucleolyse wordt
beschouwd als de voornaamste biochemische stap in apoptosis, resulterend in
cleavage van nucleair DNA in oligonueleosomale-lengte fragmenten. Daarom
wordt de aanwezigheid van aktieve celdood meestal aangetoond via een
agarose gel elektroforese. Hierbij wordt genomisch DNA geextraheerd en
geanalyseerd, waarbij dan het typische ladderpatroon (van nucleosomale DNA
fragmenten) op de gel kan onderscheiden worden. (Gavrieli, 1992). Doch,
zeer uitzonderlijk, werden toestanden beschreven waar de morfalogische
eigenschappen van apoptosis niet samengingen met oligonucleosomale DNA
cleavage (Trauth en Keesey, Boehringer). Deze laatste methode geeft echter
geen informatie wat betreft apoptosis in individuele cellen, noch kan het
cellulaire apoptasis relateren met histologische lokalisatie of
celdifferentiatie. Daarom werd de TUNEL-techniek ontwikkeld.
(Trauth en Keesey, Boehringer)

7.3.2 TUNEL (of TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)
             (Trauth en Keesey, Boehringer)
-----------------------------------------------------------

De detektie van apoptosis op niveau van individuele cellen kan gebeuren via
een enzymatische in situ labelling van apoptosis-geindueeerde DNA strand
breaks. DNA palymerase, zowel als terminale deoxynucleotidyl transferase
(TdT) werden reeds gebruikt voor de incorporatie van gelabelde nucleotiden
in DNA strand breaks in situ. De TAILING reaktie die gebruik maakt van TdT
wordt TUNEL ('TdT-mediated dUTP nick end labelling') techniek genoemd.

De stalen worden voorbehandeld met protease, nick end gelabeld met
gebiotinileerde poly dU, geintroduceerd door terminale deaxytransferase (TdT)
en dan gekleurd door gebruik te maken van avidin-geconjugeerde peroxidase.
[zie ook deel IV. C.1.3]

7.4 Apoptosis in T-lymfocyten algemeen
--------------------------------------

Precursor T-cellen worden gevormd in het beenmerg en migreren naar de thymus
om te matureren tot CD4+CD8- of CD4-CD8+ T-lymfocyten. Een strikte regulatie
van celdood is nodig om de autoreactieve T-lymfocyten (thymocyten) te
verwijderen gedurende de zoogdier-ontwikkeling : die T-cellen die receptoren
dragen die sterk interageren met self-antigenen moeten verwijderd worden,
om autoimmuniteit te vermijden. Ook cellen die niet interageren met de 'major
histacompatibility complex proteins' zullen sterven. In totaal zullen
ongeveer 95% van de T-cellen die de thymus binnenkomen sterven zonder ooit
dit orgaan te verlaten. (Nagata & Goldstein, 1995; Ellis et al, 1991)

7.5 Apoptosis in lymfocyten van CFS-patienten
---------------------------------------------

In een studie van Swanink (et al, 1996) werden leukocyt kulturen van 76
CFS-patienten en 69 gezonde 'matched' controles onderzocht op de aanwezigheid
van apoptosis. Er werd geen signifikant verschil waargenomen tussen
patienten en controles.

7.6 Apoptomis, autoimmune ziekten, kanker en andere ziekten
----------------------------------------------------------

Stoornissen in de regulering van apoptosis blijken tussen te komen of
verantwoordelijk te zijn voor een reeks aandoeningen zoals kanker, autoimmune
ziekten, AIDS, degeneratieve aandoeningen van het centraal zenuwstelsel,
hepatotaxiciteit,.. .(Ceuppens, 1996).

7.7 Besluit
-----------

Apoptosis, of geprogrameerde cel dood is het proces waarbij een cel aktief
zelfmoord pleegt onder zeer strikt gecontroleerde omstandigheden. Het
apoptotische celdood proces is geassocieerd met uitgesproken morfologische
veranderingen in de cel en intranucleosomale DNA fragmentatie. Deze criteria
helpen om onderscheid te maken tussen apoptosis en necrosis. Deze laatste
gebeurt meestal als respons op fysische schade.

8. Balans celproliferatie en apoptosis
--------------------------------------

De checkpoints van de celcyclus staan onder controle van p53. Dit betekent
dat wanneer de cel in nood verkeert, de celcyclus geblokkeerd kan worden om
herstel toe te laten of apoptosis kan geinduceerd worden. (Jacks en
Weinberg, 1996) [deel I.6]

Appendices
----------

Appendix A : Cytokines (Reichlin, 1993)
---------------------------------------

Aan de ene zijde van deze complexe reacties is nu aangetoond dat cytokines
geproduceerd kunnen worden in de hersenen door geactiveerde glia en uit
immuuncellen die binnentreden via de circulatie. Cytokine produktie kan
veranderingen veroorzaken in het humeur en de cognitieve functies en kunnen
verantwoordelijk gesteld worden voor eetluststoornissen, vermoeidheid,
verhoogde trage-golf slaap en zelfs destructie van neuronen. Sommige
cytokines, vooral interleukine 1 en 6, spelen een belangrijke rol in de
controle van hormonen gesecreteerd door de hypothalame-hypofysaire as.
Dit kan mee de anomalien in cortisol- en vasopressine-secretie helpen
verklaren. Een ander aspect van deze bidirectionele communicatie is dat de
mogelijkheid bestaat dat bepaalde aspecten van de emotionele status van de
patient anomalien in de immuunrespons kunnen veroorzaken (Shepherd, 1995).
Een overzichtsartikel (Stein et al., 1991) op basis van 22 studies over de
invloed van depressie op het immuunsysteem besloot dat er geen significant
verband bestaat tussen depressie en immunosuppressie. Toch wordt in andere
artikels gesuggereerd dat een reductie in het aantal en functie van natural
killer cellen voorkomt bij depressieve mannen (Evans el at, 1992), maar niet
bij depressieve vrouwen. Blijkbaar is nog niet duidelijk in welke mate
psychologische faktoren de immuunrespons beinvloeden in een hele reeks van
toestanden.

Appendix B: 2-5A synthetase/RNase L biosynthetische weg
------------------------------------------------------

ALGEMEEN (review Shroder et al., 1992)
--------------------------------------

Deze biosynthetische weg is centraal in het begrijpen van de virale
pathogenese. De 2-5A synthetase/RNase L biosynthetische weg is betrokken in
de cellulaire dsRNA-afhankelijke antivirale respons en maakt deel uit van het
antivirale mechanisme van IFN. 2-5A synthetase wordt (indirekt) geinduceerd
als gevolg van infektie door een breed spectrum aan virussen. Het sleutel-
enzyme is 2-5A synthetase. 2-5A synthetase wordt geactiveerd door dsRNA en
zet ATP om in 5'-gefoaforyleerd 2',5'-gelinkt oligaadenylaat (ook 2-5A
genoemd) (Lengyci et at, 1982). De aldus gevormde 2-5A bindt (allosterisch)
op en aktiveert RNase L (een endoribanuclease). RNase L hydrolyseert
enkelstrengig RNA voornamelijk na U-A, U-G en U-U sekwenties. Deze hydralyse
resulteert in de degradatie van zowel viraal als cellulair mRNA. De
konsekwentie van deze mRNA afbraak is een inhibitie van proteinesynthese
(Schoder et al., 1992). [zie Tekening nr. 1.7]

Dit 2-5A synthetase wordt geinduceerd door interferon (Hovanessian, 1985;
Cohen et al., 1988; Rutherford et al., 1988), maar het is ook detekteerbaar
in lagere concentraties in de afwezigheid van dit cytokine (Nilsen et al.,
1982). 2-5A is een serie van 2,5-linked oligoadenylaten (meestal bestaande
uit 2-4 AMP residues) met een 5'-terminale trifosfaat.

Bij HIV-1 INFEKTIE
( review Schroder et al., 1992; Suhadolnik et al., 1993)
--------------------------------------------------------

Tijdens de studie van dit 2-5A metabolisme in vitro in cellen geinfekteerd
met HIV-1, werd ten interessante observatie gedaan. Het niveau van 2-5A is
invers gecorreleerd met virus produktie. De sterke stijging in 2-5A tijdens
de initiele fase van infektie tot en met het begin van virus produktie wordt
veroorzaakt door een aktivatie van 2-5A synthetase. De aktiviteit van
2',3'- exoribonuclease, die 2-5A degradeert, verandert slechts lichtjes.
RNase L, dat geaktiveerd wordt door 2-5A, stijgt ook enorm na infektie van
de cellen met HIV-1 in vitro. Maximale RNase L niveaus worden bereikt 2-3
dagen na infektie; tijdens deze periode zijn nog geen virus partikels
vrijgelaten van de cel.

Men toonde aan dat het RNase L in staat is het HIV-1 mRNA te degraderen.
In de nucleus zijn zowel 2-5A synthetase als RNase L geassocieerd met de
nucleaire matrix; deze plaats is waarschijnlijk de site voor HIV-1 mRNA
maturatie. De produktie van 2-5A en de 2-5A gemedieerde degradatie van
HIV-1 mRNA lijken dus sterk geassocieerd door te gaan in dezelfde cellulaire
substruktuur. Later, tijdens infektie, dalen de 2-5A synthetase aktiviteit
en de RNase L aktiviteit sterk, simultaan met een stijging in virale
proteinen synthese en virus vrijlating. Deze bevinding suggereert dat agentia,
die in staat zijn om de periode, tijdens dewelke hoge niveaus van 2-5A
aanwezig zijn in de cel, te verlengen, in staat zouden zijn om de vrijlating
van HIV-1 te vermijden. De start van HIV-1 vrijlating kan inderdaad
vertraagd worden door applicatie van agentia die de dsRNA-afhankelijke
antivirale respons van de cellen stimuleren, bv. IFN (die de expressie van
het 2-5A synthetase gen induceert) en 'mismatched' dsRNA (by. Ampligen)
(welke 2-5A synthetase aktiveert) [zie ook 4.2].

Dus modulatie van de dsRNA-afhankelijke 2-5Asynthetase/RNA L biosynthetische
weg door applicatie van deze agentia lijkt een hoopvolle strategie in de
behandeling van AIDS. Twee andere strategien om HIV-infektie te bestrijden
zijn de verhoging van de intracellulaire 2-5A pool via de ontwikkeling van
2-5A analogen.

BIJ CFS
-------

Indien alle componenten van deze antivirale weg correkt werken, kan het
menselijk lichaam virus-infekties onder controle houden. Doch, bij CFS zijn
verschillende componenten defekt. Met name de biosynthetische weg is
geaktiveerd en een nieuw RNase L werd gevonden. [zie 2.5.A]

Appendix C Wat is moeheid ? (Inst Gczondheid Nederland)
-------------------------------------------------------

Moeheid is een algemeen bekend, maar moeilijk te definieren verschijnsel.
Enerzijds kan het worden beschouwd als een normale fysiologische reactie op
lichamelijke of geestelijke inspanning, anderzijds kan het worden beschouwd
als een (omvangrijk) gezondheidsprobleem (Bensing, 1995). Vanuit een
arbeidspsychologisch standpunt werd vermoeidheid traditioneel opgevat als
een afname van prestatie als gevolg van aanhoudende lichamelijke of
geestelijke aktiviteit. In meer recente benaderingen wordt moeheid eerder
gezien als een uiting van een subjektief, door motivatie beinvloed oordeel
over de eigen toestand (Meijman, 1991]. De betekenis van moeheid kan sterk
varieren. Het kan een symptoom zijn van een onschuldige verkoudheid. Maar
het kan ook een symptoom zijn van een chronische ziekte, dusdanig
invaliderend dat het de kwaliteit van leven ernstig aantast. Er is nog geen
sprake van een algemeen geaccepteerde definitie van moeheid. Wel bestaat
overeenstemming over het multidimensionele karakter van de klacht, waarbij
een algemene beleving, lichamelijke sensaties en cognitieve verschijnselen
kunnen worden onderscheiden (Smets et al.., 1995).



                             II.  DOELSTELLING
                             -----------------
Doelstelling
------------

Extreme, langdurige en algemene vermoeidheid is het meest  opvallende
kenmerk van CFS. De etiologie van deze ziekte is nog niet gekend, maar CFS
wordt o.a. gekenmerkt door een geaktiveerde anti-virale biosynthetische weg
en de aanwezigheid van een nieuw, verkort RNase L, dat eveneens betrokken is
in deze biosynthetische weg. In deze verhandeling zal nagegaan worden of de
vermoeidheid bij CFS een cellulaire en/of genetische achtergrond heeft.

Om een algemeen beeld te krijgen van de celbiologische achtergrond van de
ziekte, zal de proliferatie snelheid en de aanwezigheid van geprogrammeerde
celdood nagegaan worden; en dit in T-lymfocyten, waarvan de implicaties in
het immuun antwoord gekend zijn. Deze balans tussen celproliferatie en
celdood, die om de basis ligt van homeostasis, zal benaderd worden in vitro
in geheel bloed lymfocyten-kulturen, al dan niet blootgesteld aan chemische
stress. Om de mogelijke genetische predispositie - hetzij door mutatie,
hetzij door het falen van het repair-systeem - na te gaan bij deze patienten
zal aanvullend de gevoeligheid voor 3 (pro-)mutagenen bestudeerd worden.

De technieken die gebruikt worden om deze doelstellingen te benaderen, zijn
de Cyto-B geblokkeerde micronucleus-test en de TUNEL-test. Deze eerste
techniek leent zich immers uitstekend om een gedeeltelijk antwoord te vinden
op verschillende van de gestelde vragen. De kulturen worden gestimuleerd om
te delen en daarna behandeld met cytochalasine-B, een stof die op de actine
bindt en daardoor de cytokinesis blokkeert. De kernen delen zich wel, maar
de cel niet. Na 1 celcyclus bekomt men cellen met twee kernen en eventueel
1 of meerdere micronuclei. Een micronucleus ontstaat in een cel als bij de
deling een chromosoom of een chromosoomfragment afgezonderd geraakt van de
spoelfiguur en niet meer geincorporeerd wordt in de dochtercellen.

Dc frekwentie man meerkernige cellen geeft een schatting van het aantal
delende cellen. Uit deze gegevens kan men de proliferatie-snelheid berekenen.
Dit is vooral nuttig omdat het een maat geeft voor cytotoxiciteit of
verandering in celproliferatie-kinetiek te wijten aan het testprodukt of het
verschil tussen CFS-patienten en controle-personen. De test detekteert ook
chromosoombreuken en aneuploidie.

Aan de kulturen wordt alcohol, al dan niet met een metabolische aktivator
(S9), MMS (direkt mutagen) of cycoe (pro-mutagen) toegevoegd, om de
gevoeligheid voor deze stoffen na te gaan.

De analysen zullen gebeuren door een vergelijking te maken van de
CFS-patienten met 'matched' gezonde controle-personen. De tweede techniek
is de TUNEL-test, die zal gebruikt worden om een inzicht te krijgen in
geprogrammeerde celdood van lymfocyten van CFS-patienten. Endanucleolyse
resulterend in DNA cleavage is een typisch kenmerk van apoptosis. Deze cel
detektie test werkt via enzymatische in situ labelling van apoptosis-
geinduceerde DNA strand breaks.



                          III.  MATERIAAL EN METHODEN
                          ---------------------------

A. Algemene Inleiding
---------------------

De proliferatie-snelheid en de gevoeligheid voor (pro-)mutagenen van
T-lymfocyten bij CFS-patienten werd nagegaan a.d.h.v. de cytochalasine-
B geblokkeerde micronucleus-test. Apoptose of celsterfte bij T-lymfocyten
van CFS-patienten werd eveneens bestudeerd a.d.h.v. de TUNEL-test.
De analyse van de CFS-patienten gebeurde door een vergelijking te maken met
gezonde 'matched' controle personen. Op onderstaand schema wordt het
experimenteel werk uiteengezet. Telkens werd vanaf de bloedstalen zoveel
mogelijk materiaal verzameld, waarvan een deel bewaard werd voor latere
analyse.

B. Werkschema [zie Tabel III.1]
-------------------------------

Het bloed van in totaal 37 personen werd in kultuur gebracht. Per week werden
telkens twee stalen verwerkt. Enerzijds werd een deel van de kulturen
behandeld met mutagenen en gefixeerd; zodat men preparaten voor de cyto-B
geblokkeerde micronucleus-test bekwam. En anderzijds werd een deel van de
kulturen behandeld met colcemide en gefixeerd om metafase-preparaten te
bekomen. De metafase-preparaten konden verder behandeld worden om gebruikt
te worden voor karyotypering en de chromosoomaberratie (CA) test, doch
wegens tijdsgebrek werden deze niet meer geanalyseerd. Wel werd een deel van
deze metafasepreparaten behandeld en gebruikt voor apoptosis detektie
(TUNEL-test).

Verder werden uit het geheel bloed van deze zelfde personen RNA en DNA
geextraheerd, om dan later te gebruiken voor CFLP. Doch dit deel zal
uitgevoerd worden in het kader van de doctoraatsverhandeling van
Jr. Inge Hauspie.

Tevens werden vanaf het geheel bloed pellets gemaakt (door medewerkers van
Prof. Dr. De Meirleir). Oorspronkelijk was het de bedoeling om deze aan te
wenden voor de apoptose-detektie, doch omwille van de slechte kwaliteit werd
geopteerd om de metafase-preparaten voor dit doel te gebruiken.

Uiteindelijk waren problemen zoals de beperkte bruikbaarheid (besmette
kulturen, ontelbare preparaten, matching), organisatorische problemen en de
beperkte tijd van de verhandeling er verantwoordelijk voor dat slechts
11 CFS-patienten en 11 'matched' centroles werden geanalyseerd in de
cytochalasine-B geblokkeerde micronucleus-test en de apoptosis-detektie.

C. Patienten en controles
-------------------------

1. Bloedstalen
--------------

Het bloed van de CFS-patienten werd afgenomen via venipuncture en
gehepariniseerd. Deze stalen werden verkregen via Prof Dr. De Meirleir. van
de Dienst Menselijke Fysiologie aan de VUB, die ook de selektie van de
patienten verzorgde. Vandaar dat naast het bloed van de 9 CFS-patienten,
ook het bloed van een MS (multiple sclerose)-patient en een fibromyalgie-
patient geanalyseerd werd.

Het bloed van de 'matched' controle-personen werd op dezelfde manier
afgenomen. Deels werd dit via Prof. Dr. De Meirleir verkregen. De overige
vrijwillige controle-personen werden gecontacteerd dankzij de bereidwillige
hulp van de Personeelsdienst. Dit bloed werd afgenomen door de Medische
Dienst van de VUB-Etterbeek.

Er werden in totaal vanaf 37 bloedstalen kulturen gemaakt, doch daarvan
werden er slechts 22 effektief geanalyseerd in deze verhandeling. Dit heeft
voornamelijk te maken met tijdsgebrek, maar problemen, zoals de slechte
kwaliteit van de preparaten en het verlies van goede preparaten-reeksen
omwille van de matching, speelden ook een rol.

De 'matching' van CFS-patienten met gezonde controle-personen, om latere
vergelijking toe te laten, gebeurde voor het overgrote deel enkel op basis
van leeftijd en geslacht. Voor enkele koppels bestond echter de mogelijkheid
om te vergelijken met een tweelingzus of-broer [zie IV.A).

2. Enquetelijsten
-----------------

Er werden enquetelijsten opgesteld en meer informatie te bekomen omtrent de
patienten en de controle-personen. Hierin werd onder meer gevraagd naar hun
levensgewoonten, zoals rookgewoonten, alcohol-, koffie- en theeverbruik, de
familiale geschiedenis op gebied van autoimmune ziekten, allergie, MS,
kanker e.a., eventuele beroepsblootstelling aan mutagenen/carcinogenen,
eventuele medikatie, enz.. Het kan immers van belang zijn om de
rookgewoonten van een persoon te kennen, vermits dit in vele gevallen een
verhoogde micronucleus-induktie geeft. Doch deze gegevens, die verkregen
werden via Prof. Dr. De Meirleir, waren voorlopig niet beschikbaar voor alle
patienten en ook niet voor alle controle-personen. Aangezien wij de
informatie dus niet voorhanden hadden voor iedere staalmanie werden deze
gegevens niet verwerkt in deze verhandeling.

D. Cytochalasine -B geblokkeerde In vitro micronucleus-test
-----------------------------------------------------------

1. Principe van de cyto-B MN-test:
    Algemeen
    (De in vitro cytochalasine-D geblokkeerde menselijk lymfocyten
    micronucleus-test) (Fenech en Merley, 1985)
-----------------------------------------------------------------

Een micronucleus (MN) ontstaan wanneer een chromosoom of een chromosoom-
fragment bij mitose afgezonderd geraakt van de spoelfiguur. Het wordt dus
niet meer in de dochterkernen ingepakt, maar vormt een geisoleerde micro-
kern. Door toevoeging van cytochalasine B aan een celkultuur, die bindt op
de actine van het cytoskelet, wordt de cytokinese geblokkeerd. Er treedt
dus kerndeling maar geen cytoplasmadeling op. Op die manier kan men de
cellen met micronuclei tellen; men kan onderscheid maken tussen gedeelde
(tweekernige of meerkernige) en ongedeelde (eenkernige) cellen.

De frekwentie aan binucleaire cellen geeft een schatting van het aantal
delende cellen; dit is vooral nuttig omdat het een maat geeft voor
cytotoxiciteit of veranderingen in de celproliferatie-kinetiek te wijten
aan het testprodukt. (Van Hummelen, 1994)

De cytochalasine-B geblokkeerde in vitro micronucleus-test wordt veel
gebruikt in de technologie en is relatief eenvoudig en snel. Men heeft geen
cellen in metafase nodig, maar wel cellen van metabolisch aktief weefsel.
De cyto-B geblokkeerde MN test, gekoppeld aan FISH (Fluorescent In Situ
Hybridisation ), geeft informatie over het feit of de MN ontstaan is als
gevolg van een breuk of door chromosoomverlies (Elhajouji et al., 1996).

2. Het gebruik van de cyto-B MN-test in deze verhandeling
---------------------------------------------------------

A.d.h.v. de cyto-B geblokkeerde MN-test werd de proliferatie-snelheid van
T-lymfocyten nagegaan in CFS-patienten en vergeleken met controle-personen.
Deze techniek werd ook aangewend om de gevoeligheid van 3 (pro-) mutagenen
te bestuderen.

Deze (pro-)mutagenen zijn MMS , cyclofosfamide en alcohol. MMS of methyl
methaansulfonaat werd in een concentratie van 35 ug/ml toegevoegd aan de
kulturen ('MMS, -S9') (Elhajouji et al., 1994). Het is een direkt inwerkend
mutagen, m.a.w. het alkyleert het DNA zonder voorafgaande aktivatie. Het
induceert een sterke verhoging van het aantal micronuclei in menselijke
lymfocyten (Marginson en O'Connor, 1990) en kan dus beschouwd worden als
een positieve controle t.o.v. de kulturen waarbij geen mutagen went
toegevoegd ('controle,-S9').

Cyclofosfamide is een pro-carcinogen, t.t.z. metabolisatie is nodig vooraleer
cyclofosfamide kan inwerken op het DNA. Daarom werd aan de kulturen met
cyclofosfamide ook S9 toegevoegd ('cyclo,+S9'). Men kan deze kultuurreeks
('cyclo,+S9') een als een positieve controle t.o.v. de kulturen waar geen
mutagen bijgevoegd werd, maar wel S9 ('controle,+S9'). S9 is een microsomale
leverfractie van ratten, voorbehandeld met een enzyme inducerende stof (vaak
Aroclor 1254). Deze supematans-fractie bevat de meeste enzymen nodig voor de
metabolisatie in menselijke lymfocyten. De S9 was afkomstig van Wistar
ratten en werd ens aangeboden door Janssen Pharmaceutica, Beerse. (Van
Hummelen, 1994)

Ethanol went aan de kulturen toegevoegd. In een 1% concentratie. Aan een
deel van de kulturen werd S9 toegevoegd ('alcohol,-S9'), aan een ander deel
niet ('alcohol,+S9'); om na te gaan of metabolisatie van alcohol een andere
rol speelt in CFS-patienten in vergelijking met controle-personen.

Samenvattend werden dus volgende kulturen gemaakt, telkens in tweevoud:

* controle, -S9
* controle, +S9
* alcohol, -S9
* alcohol, +S9
* MMS, -S9
* cyclo, +S9


3. Protokol / Materiaal
-----------------------

Het protokol dat hierna volgt is deze volgens (Van Hummelen en Kirsch-
Volders, 1990). Het werd ingedeeld in vier delen : het verzamelen van het
bloed, de bereiding van lymfocyten-kulturen, de overige stappen om
preparaten te bekomen voor de MN-test samen met de behandeling met mutagenen
en de kleuring.

Dit kan ken samengevat worden: De 5ml geheel bloed kulturen werd gestart in
aanwezigheid van Ham's F10 en FCS en gestimuleerd met PHA. De kulturen
werden na 24 uren blootgesteld aan de mutagenen gedurende drie uren. Daarna
werd S9 weggewassen en nieuw medium toegevoegd. Na 44 uren werd cyto-B
bijgevoegd (6 ug/ml finale concentratie) en na 72 uren werden de kulturen
geoogst. De cellen werden tweemaal met RPMI en FCS gewassen, behandeld met
een hypotonische oplossing (RPMI-H20, 1:4 en FCS) voor 10 minuten. De cellen
werden uitgestreken op preparaten en onmiddellijk gefixeerd in
methanol/azijnzuur (3:1) en methonol. Na onbepaalde tijd werden de preparaten
dan Giemsa-gekleurd om vervolgens geanalyseerd te worden onder de
lichtmicroscoop.

3.1   BLOEDINZAMELING
---------------------

Het gehepariniseerd geheel bloed werd verzameld in 50 ml steriele collectie
tubes (Calparine, Sanofi, France) via venipuncture . Nota: de overige stappen
dienden te gebeuren niet later dan twee uren volgend op de verzameling van
het bloed, om de integriteit van het sample te behouden.

3.2   LYMFOCYTENKULTUUR
-----------------------

- voorbereidingen : FCS en F10 worden uit de vriezer gehaald

- in een kultuurflesje brengt men:
   - 4 ml Ham's F10 (medium met o.a. vitaminen) (Life Technologies)
   - 0,8 ml FCS ( foetaal kalfsserum) (groeifaktoren, adhesiefaktoren,
     vitaminen en mineralen) (Life Technologies)
   - 3 druppels PHA16 (phytohaemaglutinine = mitosestimulator) (ION-Flow)
   - 0,4 ml geheel bloed

- de kultuurflesjes (totaal 5 ml) worden in een broedstoof geplaatst bij
   een temperatuur van 37 graden celcius

Vervolgens kunnen de kulturen behandeld worden voor de preparaten van de
cyto-B geblokkeerde micronucleus test of de apoptose detektie test:


3.3   Cyto-B GEBLOKREERDE MICRONUCLEUS TEST EN BEHANDELING MET MUTAGENEN
------------------------------------------------------------------------

- na 24 uren : behandeling:
         - FCS en F1O uit vriezer halen
         - positieve controles maken :1) MMS  : 2,7 ul in 1 ml F10
                                      2) cyclo: 2O mg  in 1 ml F10
- uitzetten uit vriezer: S9 (-> 7O graden celcius vriezer
                          NADP (4mM)(Sigma)-> vriezer
                          G-6-P (700 mg/ml) (glucose-6-fosfaat) (Sigma)
                          -> vriezer
                          PBS (5,16 ml) (phosphate buffered saline, pH 7)
                          -> frigo
                          F10 (52,2 ml) -> frigo
                          zoutoplossing (120 ul) -> frigo
- de flesjes met S9 (van elke patient 6 / de overige zes gebruiken
   voor - S9) overbrengen in steriele plastieken proefbuis en
   10' centrifugeren op 1500 rpm

- ondertussen S9-mix maken:
                           120 ul zout
                           60 ul NADP
                           60 ul G-6-P
                           600 ul S9
                           5,16 ml PBS (= 5 ml + 160 ul)
- in ijskast zetten
- supernatant wegzuigen en 5 ml medium ( = 52,5 ml F10 + 1,5 ml FCS
   + 6 ml S9 mix) toevoegen
- alles behandelen gedurende 3 h per persoon

            -S9 (0%), -S9 (0%)
            -S9 (1%), -S9 (1%)         ( 50 ul ethanol)
            -S9 (MMS),-S9 (MMS)        ( 50 ul MMS)

            +S9 (0%), +S9 (0%)
            +S9 (1%), +S9 (1%)         (50 ul ethanol)
            +S9 (cyclo), +S9 (cyclo)   (50 ul cyclo)

- na deze 3 uren behandelen:
- PHA uit de vriezer zetten
- buisjes 10'centrifugeren op 1500 rpm
- supernatant wegzuigen en 5 ml PBS toevoegen
- opnieuw 10' centrifugeren op 1500 rpm
- nieuw medium in kultuurflesje:
      -49 ml F10
      -9 ml FCS
      -1,2 ml PHA
- supernatant wegzuigen
- en 5 ml nieuw medium in buisje brengen
- resuspenderen
- overbrengen in kultuurflesje

- na 44 uren kultuur : + 6 ug/ml cytochalasine B (t.t.z. 200 ul + 600
   ul F10 -> 30 ul per kultuur) (Sigma Chemical Co, Belgium) bij alle
   kulturen voegen
- na 72 uren kultuur stop ( oogsten van cellen)
- FCS en RPMI medium (2g NaHCO3/l)(Life Technologies) uit vriezer zetten
- inhoud van een kultuurflesje overbrengen in plastic proefbuisje
- 10 mm. centrifugeren (1500 t.p.m.)
- supernatant wegzuigen tot ongeveer 1 ml
- suspenderen op vortex
- cellen wassen : + 8 ml (RPMI + 2%FCS) (t.t.z. 250 ml +5 ml x 2)
- 10 min centrifugeren en supernatant wegzuigen
- wassen, centrifugeren en supernatant wegzuigen
- suspenderen op vortex
- lichte hypotonische shock = 10 ml mengsel ( 1 deel RPMI + 4 delen
   water + 2% FCS) (t.t.z. 50 ml + 200 ml + 5 ml)
- goed resuspenderen
- centrifugeren en wegzuigen tot voorbij donkerrode rand
- m.b.v. pasteurpipet en peertje de resterende vloeistof boven het pellet
   verwijderen
- cellen met pasteurpipet en peertje suspenderen
- met 1 druppel bloed een uitstrijkje maken en aan de lucht laten
   drogen (lamp)
- preparaten fixeren even in methanol/ azijnzuur ( 75 ml/25 ml) en
   dan 15 min in methanol


3.4 KLEURING
------------

De preparaten werden +/- 20 minuten in gefilterde Gienisa 5% (Merck) in
Sorensen buffer (pH 6.8) gedompeld om te kleuren.


4. MICRONUCLEUS-TELLING (Tabel IV.2 en Bijlage 1)
-------------------------------------------------

- Het tellen van de preparaten gebeurde met een lichtmicroskoop, met
   een objektiefvergroting 50x en 100 x bij twijfelgevallen.

- De criteria voor het tellen van cellen met micronuclei (MN) zijn als volgt:

   - mooi afgelijnde ronde kern
   - de MN ligt apart van de macronucleus in het cytoplasma
   - ronde cellen, intakt cytoplasma
   - chromatine struktuur en kleurintensiteit van MN en
     macronucleus moeten identiek zijn
   - de diameter van de MN mag maximaal een-derde van de diameter
     van de hoofdkern bedragen

- De parameters die geteld werden op de preparaten van de cyto-B geblokkeerde
   in vitro micronucleus-test worden hierna opgesomd. Het aantal
   mononuelcaire cellen (Mono), het aantal bunucleairen (CD), het aantal
   bunuclcairen met 1 micronucleus (CB + 1 MN), het aantal bunuclcairen met
   2 micronuclei (CB + 2 MN), het aantal binucleairen met meer dan 2
   micronuclei (CB + > 2 MN), het aantal mononucleairen met 1 of meerdere
   micronuclei (Mono+MN), het aantal trinuclcaire (3N), het aantal
   tetranucleaire (4N), het aantal cellen met meer dan 4 kernen (>4 N), het
   aantal cellen in metafase (metafasen), het aantal drie- en vierkernigen
   met 1 of meerdere micronuclei ( 3 N +MN en 4 N + MN). De tellingen worden
   gedaan totdat men duizend cellen (= total cells) heeft geanalyseerd, dan
   wordt het preparaat verder geteld, maar enkel voor de eerste zes
   parameters, totdat men 1000 CB (total CB) heeft.

Opmerking: Soms is het echter niet mogelijk om 1000 cellen en 1000 CB te
tellen. Dij is te wijten aan besmette kulturen of onduidelijke preparaten.

-  De betekenis van de gebruikte afkortingen is de volgende:

   * (0%) (win S9) : deze kulturen werden niet behandeld en werden
     gebruikt als controle, ook werd geen S9 toegevoegd
   * control (0%) (plus S9) aan deze niet-behandelde kulturen werd
     S9 toegevoegd
   * alcohol (min S9) : deze kulturen werden behandeld met 1% ethanol
   * alcohol (plus S9) : deze kulturen werden behandeld met 1% ethanol
     en tevens werd S9 toegevoegd
   * MMS (min S9) deze kulturen werden behandeld met MMS
   * cyclo (plus S9) deze kulturen werden behandeld met cyclofosfamide
     en S9 werd toegevoegd

-  De formules gebruikt om het aantal mononucleairen (Mono) en het totaal
    aantal binucleairen (nMNCB) met micronuclei te berekenen zijn de
    volgende:

   *  Mono = total cells - (CB+3N +4N+(>4N)+(3N+MN)+(4N+MN)+metafasen)
   *  nCBMN is de som van (CB+MN), (CB+2MN) en (CB+>2MN)


-  De preparaten werden gecodeerd om bewuste eliminatie van bepaalde
    gegevens te vermijden. Wat betreft de aard van de persoon ( patient
    of controle) werden ook gecodeerde preparaten geteld slechts na
    telling van alle personen verkregen we deze informatie. Telkens werd
    alles in parallel geteld alle kulturen werden in tweevoud voorbereid,
    zodat 1 kultuurreeks door mijzelf kon worden geteld (kultuur 13) en
    een reeks door Gina Plas (kultuur A).


5  Verwerking van de gegevens
-----------------------------

5.1   PI, DI en % (Tabel IV.3 t.e.m. IV.24; IV.25a en b; IV.26a en b;
       IV.27a en b)
---------------------------------------------------------------------

Vanaf de bruto gegevens werden verscheidene parameters berekend. Dit
gebeurde via een zelf-ontwikkelde macro in het programma Excell 4.0 op
Macintosh. Hierbij werden de belangrijkste gegevens omgezet in percentages
en werd tevens de proliferatie-index (P1), de relatieve P1 (RPI), de
division-index (DI) en de relatieve DI (RDI) berekend.

De berekeningen werden gedaan op basis van volgende formules:

% 013 = (CB/total cells) x 100
% metafasen = (metafasen/total cells) x 100
o/oo CB +1MN = (CB+1MN/total CD) x 1000
o/oo CB+2MN = (CB+2MN/total CD) x 1000
o/oo CB+>2MN = (CB+>2MN/total CB) x 1000
o/oo nMNCB = (nMNCB/total CB) x 1000
o/oo Mono+MN = Mono+MN/total cells/total CB x CB x 1000

P1 = [(Mono + 2 x CB + 3 x [3N+4N+ (>4N)] / total cells] x 100
RPIa/c = PIa/PIc = P1 (alcohol)/PI(controle)
RPImms/c = PImms/PIc = PI(MMS)/PI(controle)
RPIcyclo/c = PIcyclo/PIc = PI(cyclo)/PI(controle)

DI = [(CB + 2 x [3N + 4N + (>4N)]) / total cells] x 100
RDIa/c = DI(alcohol,-S9)/ DI(controle,-S9)
RDIa/c = DI(alcohol,+S9) /DI(controle,+S9)
RDImms/c = DI(MMS)/DI(controle,-S9)
RDIcyclo/c = DI(cyclo) / DI(controle,+S9)

Telkens werd ook een gemiddelde gemaakt van PI, DI, en RDI voor alle
CFS-patienten (d.w.z. zonder nummers 9(MS) en 18(fibrom.)) en voor alle
overeenkomstige controle-personen (t.t.z. alle getelde controle-personen
behalve 77 en 80, de respektievelijke 'matched' controles van 9 en 18);
dit werd aangeduid met de term gem.*. Ook werd een range* (de twee uitersten
van alle waarden) aangegeven om de relevantie van de gemiddelden correct te
kunnen inschatten. In het geval van de controle-personen werd ook een
gemiddelde en een range berekend van alle controle-personen (gem. en range).

5.2 Chi-kwadraat test algemeen
------------------------------

De Chi-kwadraat-test werd uitgevoerd m.b.v. het Statistica-programma op een
Macintosh Computer. De p-waarden worden telkens gegeven. Waarden worden
signifikant verschillend geheten indien deze p-waarde kleiner of gelijk is
aan 0,05.

5.3 Chi-kwadraat voor kultuur A en B samenvoeging (Tabel IV. 28)
---------------------------------------------------------------

Vervolgens werd de Chi-kwadraat-test toegepast om te bekijken of de gegevens
van kultuur A en kultuur B voldoende gelijk waren, zodat men de
overeenkomstige gegevens kon optellen (totaal = 2000 cellen) en verder als
1 geheel gebruiken voor de verdere verwerking. De variatie tussen beide
kulturen bleek echter te groot, mogelijke redenen hiervoor worden in de
discussie besproken. Daarom werd geopteerd om bij de verdere verwerking van
de gegevens enkel de tellingen van kultuur B (geteld door mijzelf) in
rekening te brengen in deze verhandeling.

In deel IV.B.2.2 wordt een voorbeeld gegeven waaruit de onmogelijkheid tot
samenvoegen van de gegevens van kultuur A en B moet blijken. Hierbij worden
de p-waarden van de Chi-kwadraat test gegeven voor alle parameters groter
dan of gelijk aan 5.

5.4 Chi-kwadraat (Tabel IV.29)=> synthesetabel (Tabel IV.30)
------------------------------------------------------------

De volgende stappen in de verwerking van de gegevens zullen dus, zoals
gezegd, enkel gebeuren met de gegevens van kultuur B.

Bij het eerste deel van deze stap zal opnieuw de Chi-kwadraat-test toegepast
worden. Ditmaal om te bepalen waar er signifikante verschillen zijn tussen
de parameters in de te vergelijken reeksen.

Men gaat telkens voor een bepaalde parameter (CB, 3N, ...) kijken of er een
verschil is tussen de waarde voor die parameter in de eerste reeks controle
(-), alcohol(+), ...) t.o.v. de tweede reeks. T.t.z. de p-waarde van de
Chi-kwadraat wordt berekend. Op die manier worden de controles t.o.v. elkaar
bekeken, de alcohol met en zonder S9 t.o.v. elkaar bekeken, de alcoholreeksen
t.o.v. hun respektievelijk controles bekeken, de MMS-reeks t.o.v. zijn resp.
controle, en de cyclo-reeks t.o.v. zijn resp. controle. (Tabel IV.29)

Indien nu op basis van de p-waarde een signifikant verschil waar te nemen is,
zal dit aangeduid worden in een synthesetabel [zie Tabel IV.30]. In deze
tabel wordt telkens het nummer van de betrokken patient/controle bij de
overeenkomstige parameter neergeschreven, samen met een plus- of min-teken.
Een min-teken wil zeggen er bestaat een signifikant verschil tussen beide
waarden, en de eerste waarde is kleiner dan de tweede. Een plus-teken
betekent er bestaat een signifikant verschil tussen beide waarden, en de
eerste waarde is groter dan de tweede.

Opmerking wanneer een nummer dus niet voorkomt in de tabel betekent dit
ofwel dat er geen signifikant verschil waar te nemen is, ofwel dat de
betrokken waarde niet groot genoeg was om te gebruiken in de Chi-kwadraat-
test (t.t.z. < 5).

5.5   Vergelijking van parameter twee aan twee door regressie analyse
       (Grafiek IV.1 tem IV.16)
---------------------------------------------------------------------

A.d.h.v de waarden uit de gegevens-verwerking besproken in [deel III.D.
5.1] werden grafieken opgesteld (scattergrams met het programma Excel 5.1).
Hierbij werden voor alle patienten en controle-personen de volgende
parameters uitgezet t.o.v. elkaar:

o/oo Mono + MN tov % CB (Grafiek IV. 1 t.e.m. [V.4)
o/oo MNCB tov % CB (Grafiek IV.5 t.e.m. IV.8)
o/oo Mono + MN tov DI (Grafiek IV.9 t.e.m. IV.12)
o/oo MNCB tov DI (Grafiek IV. 13 t.e.m. IV. 16)

Dit werd gedaan in het geval van 'controle zonder S9, 'alcohol met en
zonder S9', en 'cyclo,+S9'.

E. Apoptose - detektie via TUNEL (In Situ Cell Detection kit, AP)
    (1684809; Boehringer, Mannheim)
-----------------------------------------------------------------

1. Principe
-----------

1.1. Inleiding (Trauth en Keesey, Boehringer)
---------------------------------------------

Apoptosis is een fysiologisch zelfmoordmechanisme. Over het algemeen
vertonen cellen die apoptose ondergaan een karakteristiek patroon van
structurele veranderingen in de nucleus en het cytoplasma; o.a. snelle
blaasvorming van de plasma membraan en nucleaire desintegratie. De nucleaire
collaps is geassocieerd met enorme schade aan het chromatine en DNA-cleavage
in oligonucleosomale-lengte DNA fragmenten, na aktivatie van een calcium-
afhankelijk endogeen endonuclease.

Verscheidene methoden zijn reeds beschreven om apoptotische cellen te
identificeren. Endonucleolyse wordt beschouwd als de hoofd-biochemische stap
in apoptose; resulterend in cleavage van nucleair DNA in oligonucleosome-
lengte fragmenten. Daarom wordt dit proces voornamelijk gebruikt voor de
detectie van apoptose a.d.h.v. de typische 'DNA ladder' op agarose gels
gedurende elektroforese. Deze methode geeft echter geen informatie wat
betreft apoptose in individuele cellen, noch kan het cellulaire apoptose
relateren met histologische lokalisatie of celdifferentiatie.

De detektie van apoptosis op niveau van individuele cellen kan wel gebeuren
via enzymatische in situ labelling van apoptose-geinduceerde DNA strand
breaks. DNA polymerase, zowel als terminale deoxynucleotidyl transferase
(TdT) werden reeds gebruikt voor de incorporatie van gelabelde nucleotiden
in DNA strand breaks in situ. De TAILING reactie die gebruik maakt van TdT
werd beschreven als ISEL (in situ end labelling) of TUNEL (TdT-mediated
dUTP nick end labelling) techniek. Deze techniek heeft verschillende
voordelen in vergelijking met ISNT (in situ nick translation), de technick
die gebruik maakt van DNA polymerase, namelijk:

- de label intensiteit van apoptotische cellen is hoger met TUNEL dan
   met ISNT, met als gevolg een hogere sensitiviteit
- de kinetiek van nucleatide incorporatie is zeer and met TUNEL
   i.vgl.m ISNT
- TUNEL labelt preferentieel apoptose i.p.v. necrose of primaire DNA
   strand breaks geinduceerd door antitumor drugs of radiatie.

1.2. Toepassingen
-----------------

The 'in situ cell death detection kit' is ontworpen als een preciese, snelle
en simpele, niet-radioaktieve techniek om apoptotische celdood op individueel
cel niveau te detekteren en te kwantificeren. Dus kan deze techniek aangewend
worden in verschillende assay-systemen, o.a.

-  detectie van individuele apoptotische cellen in bevroren of formaline-
    gefixeerde weefsel-sectie in basis research en routine pathologie
-  bepaling van de gevoeligheid van maligne cellen voor drug geinduceerde
    apoptose in kanker-onderzoek en klinische oncologie
-  typeren van cellen die celdood ondergaan in heterogene populaties via
    dubbele- staining procedures

1.3.  Test Principe
-------------------

Cleavage van genomisch DNA gedurende apoptose kan leiden tot zowel double-
stranded, laag molekulair gewicht DNA fragmenten (mono- en oligonucleosomen)
als ook single-stranded breaks ( 'nicks') in hoog molekulair gewicht DNA.
Deze DNA strand breaks kunnen geidentificeerd worden door het labelen van de
vrije 3'-OH DNA uiteinden met gemodifieerde nucleotiden in een enzymatische
reactie. In deze kit wordt TdT (dat polymerisatie van nucleotiden op vrij
3'-OH DNA uiteinden, op een template-onafhankelijke manier, katalyseert)
gebruikt om de DNA strand breaks te labelen [zie Fig. III.1]. Geincorporeerd
fluorescein wordt gedetecteerd door anti-fluorescein antibody Fab
fragmenten van schaap, geconjugeerd met alkaline fosfatase. Na substraat-
reactie, kunnen gekleurde cellen geanalyseerd worden onder de
lichtmicroscoop.

2. Protokol / Materiaal
-----------------------

2.1   BLOEDINZAMELING (analoog met B.2)
---------------------------------------

2.2   LYMFOCYTENKULTUUR (analoog met B.2)
-----------------------------------------

2.3 PROTOKOL preparaten-aanmaak: METAFASE-PREPARATEN
----------------------------------------------------

- na 46,5 h kultuur: bij alle kulturen toevoegen : 2 druppels (+1- 100 ul)
   colcemide (10 mg/ml)(Gibco), 10 ug/ml ( stapt de metafase door
   spoelfiguurinhibitie)
- na 48 h kultuur : stop (uitnemen uit de broedstoof)

Fixatie en spreiding van de cellen:

- inhoud van kultuurflesje overbrengen in een plastic proefbuisje
- 10 min centrifugeren (1500 tpm)
- supernatant wegzuigen
- resuspenderen door tikken tegen buis
- 10 ml KCI 0,075 M toevoegen (= hypotonische shock) (breken van de
   spoeldraden => chromosomen uitgespreid in de cel)
- 15 min inkuberen bij 37 graden celcius
- 10 min centrifugeren (1500 tpm)
- supernatant wegzuigen
- 3 ml fixator druppelsgewijs op vortex toevoegen
   (methanol/azijnzuur 3/1 = 75m1 /25ml x 2 voor 2 patienten)
- 10 mm centrifugeren en supernatant wegzuigen
- tweede fixatie + derde fixatie en 40 min laten rusten (minimum)
- centrifugeren en supernatant wegzuigen tot 0,3 ml
- homogeniseren en spreiden (water sprenkelen op dekglaasje oftewel
   eens onderdompelen in water, dan 3 druppels met pasteurpipet laten
   vallen op glaasje)

OPMERKING: Eens gefixeerd, mag er altijd onderbroken worden en mogen
de samples in de ijskast bewaard worden.

2.4 TUNEL-kit
-------------

- preparaten met gefixeerde cellen wassen in PBS
- preparaten spoelen in de permeabilisatieoplossing op ijs; di. 0,1%
   Amonium citraat (om inwendig milieu van de cel in evenwicht te houden)
   + 0,1% Triton (voor permeabilisatie van de membraan)
- 2x wassen in PBS
- Tunel reactie mengsel maken : voeg enzyme oplossing bij de label
   oplossing en centrifugeer eventjes
- 50 ul Tunel reaktie mengsel op preparaten brengen + dekglaasje opleggen
- incubatie in vochtige kamer voor 1 uur (37 graden Celcius)
- wassen 3x in PBS
- dompelen in alcaholreeks (50%, 75%, 100%)
- propidium/antifade (=counterstaining) + dekglaasje
- klaar voor analyse onder de fluorescentie-microscoop

2.5 Opmerking:
--------------

De metafasepreparaten zouden oorspronkelijk gebruikt worden voor karyo-
typering en de detektie van strukturele chromosoomaberraties (CA). Hiervoor
dienden een deel van de preparaten gebandeerd te worden met trypsine. Doch
dit werd in deze verhandeling niet verder geanalyseerd. Tevens werden
metafase-preparaten bewaard met de bedoeling om ze later voor FISH-analyse
(door ir. Inge Hauspie) te gebruiken. Doch een aantal hiervan werden
noodgedwongen gebruikt voor de analyse van apoptosis, vermits de
preparaten die vanaf de pellets werden gemaakt voor apoptosis analyse van
te slechte kwaliteit waren.

G-binding voor chromosoomaberratie-test
---------------------------------------

Dit is veruit de meest gebruikte techniek om chromosomen te kleuren en
identificeerbaar te maken. Door behandeling met een protease (trypsine)
bekomt men een typisch patroon van lichte en donkere banden. Aangenomen
wordt dat de donkere banden AT-rijk DNA en weinig aktieve genen bevatten

Techniek: preparaten van ongeveer 2 weken tot 2 maanden oud
(of 60 graden Celcius overnacht ) worden als volgt behandeld:

- 1 potje bactotrypsine wordt opgelost in 20 ml gedistileerd water
   ( = 2,5 % van een trypsine 1/250 oplossing) en wordt verdeeld in porties
   van 1 ml en ingevroren ( stock) -> diepvriezer 2e labo
- 0,5 ml stock oplossen in 100 ml Hank's - ( zonder Ca++,Mg++ en
   fenolrood) -> 10 tot 60 sec. { Opm :10 a 15 s voor blanco; CFS : 20 of
   40 of 60}-> 1e labo
- gedestileerd water: 5 sec
- Hank's: 30 sec -> 1e labo
- Giemsa 3 % : 5 min -> 5 ml Giemsa in 95 ml gemaakte Sorensen buffer
   (indien niet gemaakt -> 200 maal verdunnen) + filteren!
- spoelen in gedistileerd water
- bewaring: dompelen in xylol (zie 2e labo) + druppel DPX + dekglaasje

3. Tellingen
------------

De apoptosis-detektie gebeurde a.d.h.v. een fluorescentiemicroscoop, met een
63x objektiefvergroting. De apoptotische cellen waren herkenbaar aan de
groene kleur [zie ook foto op voorblad]. Er werden 4000 cellen geteld, en
niet 2000 cellen zoals gewoonlijk het geval is (refl). De apoptotische
cellen waren te herkennen aan de groene kleur. De preparaten werden
gecodeerd voor het tellen.

Wegens tijdsgebrek konden alle preparaten niet geanalyseerd worden. Op twee
na werden alle CFS-patienten geteld, maar slechts twee controle-personen
(nummers 35 en 28) werden geanalyseerd.

4. Verwerking van de gegevens : Chi-kwadraat-test
-------------------------------------------------

De bedoeling was om de gegevens van de apoptosis-detektie van de
CFS-patienten te vergelijken met de overeenkomstige waarden voor de matched
controle-personen. Doch, wegens tijdsgebrek konden alle preparaten niet
geanalyseerd worden. Er zijn twee 'matching' koppels (nameijk 35/36 en
27/28). Hiervoor werd nagegaan of de waarden voor apoptosis-detektie
signifikant verschillend zijn. Dit gebeurde a.d.h.v. de Chi-kwadraat test,
m.b.v. het programma Statistica op Macintosh.

F. DNA-extractie (Qiamp Blood kit (250) cat n0 29106) (Qiagen)
--------------------------------------------------------------

De reden om DNA te extraheren is opnieuw om het later, los van deze
verhandeling, aan te wenden in de CFLP-methode [zie deel III.B]. Het
verkregen DNA wordt bewaard bij 40 graden Celcius. De extractie gebeurde
m.b.v. een kit, welke een grote opbrengst geeft. De lymfocyten in het
geheel bloed werden gelyseerd in aanwezigheid van proteinase K en een
buffer. Proteinase K zorgt voor eiwitafbraak. De uiteindelijke zuivering
van het DNA gebeurde met behulp van kolommen (spin column) voorzien van een
silica membraan. Het DNA wordt geabsorbeerd op de membraan tijdens een korte
centrifugatiestap. Aangepaste zout-en pH-condities in het lysaat zorgden
ervoor dat proteinen en andere contaminanten niet vastgehouden worden op de
membraan. Onzuiverheden kunnen namelijk de PCR-reaktie inhiberen. Het
gebonden DNA werd vervolgens gewassen. De wascondities verzekeren volledige
verwijdering van mogelijke contaminanten zonder enig effekt op de
DNA-binding. Het gezuiverd DNA werd geelueerd van de membraan met een
elutiebuffer (70 garden Celcius). (De Boeck, 1996)

Het protokol is als volgt:

(0) - bad op 70 graden Celcius
(1) - 200 ul bloed in een 1,5 ml eppendorf brengen
(2) - 25 ul proteinase K (ijskast 2e steriele kamer) + 200 ul buffer AL
       (lyse) toevoegen en 15 sec vortexen (direkt!)
(3) - incubatie voor 10 min bij 70 graden Celcius
(4) - 210 ul ethanol toevoegen + vortexen
(5) - spin column in een 2 ml tube brengen
       - met pasteurpipet het mengsel aanbrengen op spin-column
       - centrifugeren voor 1 min
       - nieuwe 2 ml collection tubes + gooi flow-trough weg
(6) - open + 500 ul buffer AW toevoegen
       - centrifugeer voor 1 min
       - plaats elutiebuffer in bad ( 2 ml voor 2 patienten)
       - plaats in een nieuwe 2 ml collection tube
       - gooi flow-trough weg
(7) - open + 500 ul buffer AW toevoegen
       - centrifugeer voor 1 min + 2 min op volle snelheid
(8) - plaats de spin column in een nieuwe 1,5 ml collection tube
     - gooi flow-trough weg
(9) - open + elueer (= 200 ul elutiebuffer toevoegen)
       - plaats het geheel 5 min in bad (70 graden Celcius)
       - centrifugeer 1 min
(10)- alle samples samenbrengen in 1 eppendorf met een pasteurpipet
(11)- bewaren bij 4 graden Celcius


G. RNA - extractie (RNeasy Total RNA kit(250) cat nO 74106) (Qiagen)
--------------------------------------------------------------------

Het RNA werd geextraheerd uit het bloed van alle 37 personen. Deze stalen
worden bewaard bij -20 graden Celcius en zullen in een latere fase, los van
deze verhandeling, aangewend worden in de CFLP-methode [zie deel III.B].
De extractie gebeurde a.d.h.v. een kit. De lymfocyten in het geheel bloed
werden gelyseerd met een lyse buffer. Na centrifugatie wordt ethanol
toegevoegd. Het mengsel wordt op een kolom aangebracht en gecentrifugeerd.
Daarna wordt de kolom gewassen met twee verschillende buffers. Het RNA wordt
vervolgens van de membraan geelueerd met Rnase-vrij water.

Het protokol volgt hierna:

(1) - 350 ul RLT -buffer (lyse) + 200 ul bloed in 1,5 ml eppendorf
(2) - centrifugeren voor 3 min op volle snelheid ( pas op pellet,
       niet nemen)
(3) - 350 ul ethanol ( 70 %) (= Falcon (5/50) : 35 ml ethanol (100 %) +
       aanvullen tot 50 ml) + mixen met het pipet!
(4) - breng dit mengsel aan op de RNeasy spin column met pasteurpipet
       (max 700 ul)
       - centrifugeer 15 sec
       - giet de flow-through weg en houdt de collection tube
(5) - was met 700 ul RW1
     - centrifugeer 15 sec
     - get flow-through weg en neem nieuwe collection tube (2 ml)
(6) - 500 ul RPE
     - centrifugeer 15 sec
     - giet flow-trough weg en houdt de collection tube
(7) - 500 ul RPE
     - centrifugeer voor 2 min!
     - giet flow-trough weg
     - neem nieuwe 1,5 ml eppendorf ( provided)
(8) - elueer met 30 ul DEPC of RNase-vrij water ( op membraan !)
       - centrifugeer 1 min
(9) - recupereer alles in een 1,5 ml eppendorf ( datum + nummer)
(10)- bewaar bij -20 graden Celcius



                          IV.  RESULTATEN
                          ---------------

A. Gegevens patienten en controles
----------------------------------

In onderstaande Tabel IV. 1 werden de code-nummers van de patienten gegeven,
samen met de code-nummers van de overeenkomstige 'matched' controle-personen.
Telkens werd ook het geboortejaar en het geslacht vermeld. Indien er sprake
is van een familieband werd die ook aangegeven. In twee gevallen betrof het
niet een CFS-patient, maar personen lijdend aan Multiple Sclerose (MS) en
fibromyalgia (fibrom.).


Tabel IV 1: gegevens patienten en 'matched' controle-personen
------------------------------------------------------------------------
  patient  type       controle geboorte.-  geslacht    relatie
                      persoon   jaar
------------------------------------------------------------------------
   9        MS          80       1959        vrouw
   10       CFS         78       1961        vrouw
   11       CFS         52       P           vrouw
   14       CFS         51       1962?       vrouw
   18       fibrom.     77       1943        vrouw
   28       CFS         27       1965        man         broers
   30       CFS         49       1966        vrouw
   36       CFS         35       ?           vrouw       zussen
   37       CFS         79       1963        vrouw
   38       CFS         75       1965        vrouw
   43       CFS         76       1974        vrouw
------------------------------------------------------------------------

Vermits verdere informatie (omtrent bv. rookgewoonten, alcohol- en
koffieverbruik, ... ) voorlopig niet beschikbaar is voor de meeste controles
en ook niet voor alle patienten werden deze niet vermeld.
De reden hiervoor werd verder uitgewerkt in [deel II.C. 1 en 2]

3. Cytochalasine-D geblokkeerde in vitro micronucleus-test
----------------------------------------------------------

1) Tellingen
------------

De resultaten van de tellingen zijn terug te vinden in Bijlage. Een
voorbeeld van gegevenstellingen werd ter illustratie voorgesteld in
Tabel IV.2.

De betekenis van de gebruikte afkortingen in de tabel is de volgende:

* control (0%), min S9 : deze kulturen werden niet behandeld en
   werden gebruikt als controle, ook werd geen S9 toegevoegd
* control (0%), plus S9 : aan deze niet-behandelde kulturen werd
   S9 toegevoegd
* alcohol (1%), min S9 : deze kulturen werden behandeld met 1% ethanol
* alcohol (1%), plus 59 : deze kulturen werden behandeld met 1% ethanol
   en tevens werd S9 toegevoegd
* MMS, mm S9 : deze kulturen werden behandeld met MMS; d.i. de
   positieve controle
* cyclo, plus S9 : deze kulturen werden behandeld met cyclofosfamide
   en S9 werd toegevoegd; d.i. de positieve controle met S9


2) Verwerkte gegevens
---------------------

2.1) Percentages, proliferatie-index (P1) en divisie-Index (DI)
---------------------------------------------------------------

a) In Tabellen IV.3 t.e.m. IV.24 werden de gegevens van alle patienten
en controle-personen omgezet tot percentages. Ook het totaal aantal getelde
lymfocyten en het totaal aantal binucleaire cellen werden weergegeven in
deze tabellen opdat men de betekenis van de percentages correct zou kunnen
inschatten. De gebruikte formules werden beschreven in [deel III.D.5.1].

Enkele opvallende elementen uit deze tabellen zijn:

-  Bij de reeksen die behandeld werden met MMS konden van de
    CFS-kulturen(22) en de controle-kulturen (22) respektievelijk 7 en 14
    kulturen niet geanalyseerd worden omdat alle cellen vernietigd waren.
    Deze zijn kulturen met MMS waarbij geen cellen te tellen waren zijn:

*  CFS-nummers: 1O (kultuur B), 11(B), 28(A en B),30 (B), 36(A en B)
*  controle-nummers : 27 (A en B), 35 (A en B), 49 (A en B), 51 (A en 5),
    52 (A en H), 79 (A en B), 80 (A en B)
*  MS en fibrom. :9 ((AenB)en 18(A)

-  Bij de kulturen die behandeld werden met cyclofosfamide konden van de
    CFS-kulturen (22) en de controle-kulturen respektievelijk 7 en 6
    kulturen niet geanalyseerd worden.

-  Er bestaat een grote interindividuele variabiliteit tussen zowel de
    CFS-patienten onderling, als de controle-personen onderling.

Doch om dit objektiever te kunnen beoordelen en beter verschillen te kunnen
onderscheiden werden grafieken opgesteld waarin alle CFS-personen vergeleken
werden met alle controle-personen [zie deel IV.2.4].

b) In Tabel IV.25a werden de proliferatie-indices (PI) weergegeven voor
    elke persoon, telkens voor alle reeksen (t.t.z. controle zonder en met
    S9; alcohol zonder en met S9; MMS; en cyclo) en dit voor kultuur A. In
    Tabel IV.25b werd hetzelfde als in Tabel IV.25a weergegeven, maar voor
    kultuur B. De formules die gebruikt werden voor de berekeningen werden
    gegeven in [deel III.D.5.1].

Het commentaar omtrent de proliferatie-indices is analoog met die van
de divisie-indices.

a) In Tabel IV.26a en IV.26b werd op analoge wijze de divisie-indices
    (DI) gegeven. De gebruikte formules zijn terug te vinden in
    [deel III.D.5.1]

Hieronder werd een overzicht gegeven van de gemiddelde waarden van DI, voor
alle CFS-patienten en voor alle 'matched' controle-personen.


Tabel IV,26c: qemiddelde waarden van de divisie-indices voor kultuur B
-------------------------------------------------------------------------
DI            controle,   controle,   alcohol,-   alcohol,    MMS,   cyclo,
(Kultuur B)   -S9         +S9         S9          +S9         S9     +S9
-------------------------------------------------------------------------
CFS           79,9        85,0        55,8        91,0        26,9   86,0
gem*
-------------------------------------------------------------------------
controle      92,3        86,3        80,9        92,2        86,0   63,9
gem*
-------------------------------------------------------------------------


Wat opvalt in deze gegevens van de DI-gemiddelden is:

- Bij CFS-patienten voor alcohol, bij toevoeging van S9 steeg de
   'gemiddelde' divisie-index. Dit is niet het geval voor de
   controle-personen
- Wanneer geen S9 toegevoegd werd is de 'gemiddelde' divisie-index bij
   controle-personen hoger dan bij CFS-patienten, zowel in het geval van
   alcohol als controle.
- Bij MMS, is de 'gemiddelde' divisie-index bij controle-personen veel
   hoger dan bij CFS-patienten

Vanaf deze gemiddelden mag men echter geen (echte) conclusies trekken om
verschillende redenen. De range van de waarden in vele gevallen is zeer groot
(de inter-individuele variabiliteit is te groot binnen de groep van de
patienten) en men kan dus niet echt van een groep spreken. Ook kan men geen
Chi-kwadraat-test toepassen (om te zien of de verschillen die we opmerken
wel signifikant verschillend zijn) vermits de DI een waarde is die berekend
wordt a.d.h.v. percentages. De reden waarom deze gemiddelden dan wel
berekend werden was om een idee te hebben van eventuele tendensen die dan
misschien achteraf kunnen bevestigd worden; bijvoorbeeld m.b.v. andere
verwerkingsmethoden en/of door het analyseren van grotere groepen personen.

2.2) Samenvoegen van de overeenkomstige tellingen van kultuur A en kultuur B
-------------------------------------------------------------------------

Om te bepalen of de gegevens van kultuur A en B voldoende gelijk waren zodat
men ze kon optellen en verder bespreken als 1 geheel, werd de Chi-kwadraat
test [deel III.D.5.2 en III.D.5.3] toegepast voor elke getelde waarde. De
variatie tussen beide kulturen bleek echter te groot. De mogelijke redenen
hiervoor worden besproken in deel V. Opdat de variatie tussen de twee
kulturen A en B te groot was werd geopteerd om enkel de tellingen van
kultuur B (door mijzelf geteld) in rekening te brengen voor de verdere
verwerking in deze verhandeling.

Ter illustratie werd 1 voorbeeld gegeven in Tabel IV.28, waaruit de
onmogelijkheid tot samenvoegen van de gegevens van beide kulturen blijkt.
Men kan uit de p-waarden duidelijk besluiten dat heel veel van de waarden
niet mogen samengevoegd worden omdat ze signifikant verschillend zijn. Dit
is slechts 1 voorbeeld, doch deze onmogelijkheid tot samenvoegen komt bijna
bij alle geanalyseerde personen voor.

2.3  Synthesetabel van signifikant verschillende parameters
-----------------------------------------------------------

Tabel IV.29 geeft een voorbeeld van de toepassing van de Chi-kwadraat test.
Deze werd hier gebruikt om te bepalen of er signifikante verschillen zijn
tussen de parameters ( by. OB, 4N, MNCB,...) in de te vergelijken reeksen
(bv. controle-S9 t.o.v. controle +S9). Bovenaan het blad worden de tellingen
gegeven en onderaan het blad de p-waarden. Een * betekent dat ze signifikant
verschillend zijn.

Op deze manier werden alle p-waarden berekend voor alle personen. Vervolgens
werd een Tabel opgesteld om alle signifikant verschillende parameters van
alle personen samen te vatten [Tabel IV.30 ]. Voor de uitleg omtrent de
test, de symboliek en de voorstelling wordt verwezen naar [deel III.D.5.4].

In Tabel IV.30 kan men het volgende opmerken bij het aantal CB in de reeks
alcohol(-S9)/alcohol,(+S9) kan men een verschil opmerken tussen de
CFS-patienten en de controle-personen. De CFS-patienten hebben een hoger
aantal binucleairen (CB) bij toevoeging van S9 in vergelijking met de
kulturen zonder S9. Dit is in tegenstelling met de observatie voor de
controle-personen bij toevoeging van S9 hebben zij een lager aantal
binucleairen (CB) dan het geval is bij de kulturen zonder S9.

2.4  Vergelijking van parameters twee aan twee door regressie analyse
---------------------------------------------------------------------

Vanaf de gegevens in Tabellen IV.3 t.e.m. IV.24 werden regressies uitgewerkt.
De manier waarop dit werd gedaan vindt men terug in [deel III.D.5.5].
Hieronder worden de grafieken beschreven, vooreerst per grafiek, daarna per
categorie van vier, en vervolgens wordt het geheel van de zestien grafieken
bekeken. De personen die afwijkende waarden hebben t.a.v. het overgrote deel
van de groep worden beschreven. Telkens wanneer het niet mogelijk was om het
vooropgestelde totaal aantal lymfocyten (1000) of het totaal aantal
binucleairen (CB) (1000) te analyseren, om redenen die worden aangehaald in
[deel [III.D.5.5], wordt dit vermeld.

a) CB versus o/oo Mono + MN
---------------------------

In grafiek IV.1 t.e.m. IV.4 werden de waarden voor het aantal manonucleairen
met micronuclei per 1000 binucleairen (o/oo Mono+MN) uitgezet tegenover de
waarden voor het percentage binucleairen (%CB). Dit gebeurde respektievelijk
voor de reeksen 'Controle zonder S9', 'Alcohol' zonder en met S9, en
'Cyclofosfamide'(cyclo).

* Grafiek IV.1 (controle, -S9):
-------------------------------
   -  Wat betreft micronucleus-aantal ziet men een aantal uitzonderingen,
      nl. nummers 10, 28, 43 (CFS), en 18 (fibrom]. Wat betreft de
      proliferatie (%CB) kan nummer 18 (fibrom.) beschouwd worden als
      een uitzondering.
   -  Enkel voor nummer 18 (fibrom.) konden geen 1000 CB geteld worden.

* Grafiek IV.2 (alcohol, -S9):
------------------------------
   -  Men kan persoon 27 (contr.) zeker als een sterke afwijking van de
      algemene trend zien. Ook nummers 49 (contr.), 9 (MS) kan men als
      een uitzondering zien, zowel wat betreft micronucleus-aantal, als
      het %CB. Nummer 43 heeft geen doorsnee MN-aantal in vergelijking
      met de anderen. Voorts heeft nr 10 (CFS) een afwijkend proliferatie-
      gedrag t.o.v. de overige personen (t.t.z. een laag %CB).
   -  De nummers 9(MS), 27, 52 en 80 (contr.) konden niet volledig geteld
      worden. Bij nummer 18 konden zelfs geen 500 cellen geteld worden.

* Grafiek IV.3 (alcohol, +S9):
------------------------------
   -  De uitzonderingen hier zijn de nummers 30 (CFS) en 18 (fibrom.)
      op gebied van MN-aantal. Nummer 35 (controle) kan als een persoon
      met licht verhoogde MN-aantal bestempeld worden. Hierbij dient
      opgemerkt te worden dat bij nummers 51, 52, 80 (cont.) niet tot
      1000 CB kon worden geteld. Bij nummer 11 (CFS) konden geen 1000
      cellen worden geteld en bij personen 18 (fibrom.) en 30 (CFS)
      zelfs geen 500 cellen.

* Grafiek IV.4 (cyclo, +S9):
----------------------------
   Hier kunnen duidelijk drie uitzonderingen geobserveerd worden.
   Namelijk nummers 18 (fibrom.) en 27 (contr.) zijn afwijkend voor
   zowel MN-aantal als het %CB; nummer 9 (MS) vertoont een abnormale
   MN-aantal t.o.v. de anderen. Op deze drie uitzonderingen na werd
   bij de overige personen geen micronucleus-induktie waargenomen.
   Er dient rekening gehouden te worden met het feit dat bij nummers
   18 (fibrom.) en 49 (contr.) geen 1000 CB werden geteld. Bij 49
   (contr.) werd zelfs het aantal van 500 CB niet gehaald.

* Algemeen
----------
   Wanneer men de vier grafieken in deze reeks onderling vergelijkt, valt
   het volgende op bij vergelijking van IV.2 (alcohol.-S9) en IV.3
   (alcohol, +S9) ziet men dat over het algemeen bij CFS-patienten het
   MN-aantal veel groter is in het eerste geval (zonder S9) dan in het
   tweede (+S9); doch deze verschillen zijn miniem en de waarden voor het
   aantal micronuclei blijven voor beide grafieken binnen de normale range.

b) % CD versus % MNCD
---------------------

In Grafiek IV.5 t.e.m. IV.8 werden de waarden voor het aantal binucleairen
met micronuclei per 1000 binucleairen (o/oo MNCB) uitgezet tegenover deze
voor het percentage binucleairen (%CB). Dit gebeurde respektievelijk voor
de reeksen 'controle zonder S9', Alcohol' zonder en met S9, en
'Cyclofosfamide'.

* Grafiek IV.5 (controle,-S9):
------------------------------
   De uitgesproken uitzonderingen in deze grafiek zijn nummers 18 (fibrom.),
   9 (MS) en 14 (CFS) op gebied van micronucleus-induktie. Het nummer 10 kan
   men eventueel als een uitzondering bekijken, doch waar men de grens moet
   trokken is niet altijd duidelijk. Men kan in deze grafiek ook min of
   meer een onderscheid maken tussen CFS-patienten en controle-personen;
   t.t.z. de micronucleus-induktie is over het algemeen groter dan die bij
   de controle-personen. Men kan als het ware bijna twee (weliswaar
   overlappende) wolken onderscheiden. Bij de nummers 18, 52 en 80 konden
   geen 1000 cellen geteld worden.

* Grafiek IV.6 (alcohol, -S9):
------------------------------
   Hier kunnen een aantal uitzonderingen aangeduid worden. Nummers 27
   (contr.), 9 (MS) en 10 (CFS) hebben duidelijk afwijkende waarden voor
   zowel de micronucleus-induktie als het percentage binucleairen (%CB).
   Nummer 49 heeft een afwijkende waarde voor het %CB. In dit geval was het
   niet mogelijk om voor de nummers 9 (MS), 52 en 27 (cont.) tot een totaal
   aantal binucleairen van 1000 te komen. Voor nummers 18 (fibrom.) en 80
   kon er zelfs niet tot 1000 cellen geteld worden.

* Grafiek IV.7 (alcohol, +S9):
------------------------------
   Deze tabel vertoont geen echte uitzonderingen, behalve misschien nummer
   9 (MS) die een licht verhoogde micronucleus-induktie heeft t.o.v. de rest.
   In de volgende gevallen kon er niet ten volle (tot 1000 cellen) geteld
   worden: 52, 1, 80 (contr.), 11, 30 (CFS), en 18 (fibrom).

* Grafiek IV.8 (cyclo):
-----------------------
   In dit geval kan men zien dat nummers 18 (fibrom.) en 9 (MS) duidelijk
   afwijkende waarden hebben wat betreft micronucleus-induktie t.a.v. het
   geheel. Nummer 27 is een twijfelgeval. Bij nummer 18 konden geen 1000
   cellen geteld worden, bij nummer 49 zelfs geen 500 binucleairen.

* Algemeen:
-----------
   Wanneer men deze vier grafieken onderling vergelijkt kan men het volgende
   opmerken bij grafiek IV.6 (alcohol,-S9) en IV.7 (alcohol,+S9) kan men een
   verschil waarnemen in het aantal micronuclei van CFS-patienten; nl. een
   hogere MN-induktie bij de kulturen zonder S9 dan bij die met S9. In het
   geval van S9-toevoeging kan men zelfs spreken van een ('gemiddelde')
   MN-induktie bij CFS die even hoog ligt als deze van de controles.

c) DI versus %. Mono + MN
-------------------------

In Grafiek IV.9 t.e.m. IV. 12 werden de waarden voor het aantal
monanucloairen met micronuclei per 1000 binucleairen (o/oo Mono+MN) uitgezet
tegenover de waarden voor de divisie-index (DI). Dit gebeurde respektievelijk
voor de reeksen 'Controle zonder S9', Alcohol' zonder en met S9, en
'Cyclofosfamide'.

In deze Grafieken ( IV.9, IV.10, IV.11, IV.12 ) kunnen dezelfde
uitzonderingen teruggevonden worden en dezelfde opmerkingen gemaakt worden
als in respektievelijk de Grafieken IV. 1, IV.2, IV.3 en IV.4. . Dit geldt
zowel voor het MN-aantal, het proliferatie-gedrag als de nummers die niet
ten volle konden geteld worden. De divisie-index is immers een parameter
waarin het percentage binucleairen een grote rol speelt [zie deel
III.D.5.1], vandaar dat men analoge conclusies kan trekken. Een uitzondering
hierop is in Grafiek IV.11 (alcohol,+S9) het nummer 75 (cont.) heeft een
verhoogde divisie-index (DI).

d)  DI versus o/oo MNCB
-----------------------

In grafiek IV13 t.e.m. IV16 worden de waarden voor het aantal binucloairen
met micronuclei per 1000 binucleairen (o/oo MNCB) uitgezet tegenover de
waarden voor de divisie-index (DI). Dit gebeurde respektievelijk voor de
reeksen 'controle zonder S9', 'Alcohol' zonder en met S9, en
'Cyclofosfamide'.

Hier geldt dezelfde opmerking als hierboven [deel IV.B.2.4.c]. Men kan uit
de Grafieken IV.13, IV.14, IV.15, IV.16 dezelfde conclusies trekken als uit
de repektievelijke Grafieken IV.5, IV.6, IV.7, IV.8. Doch enkele
uitzonderingen hierop zijn:
- In grafiek IV. 14 heeft nummer 49 (contr.) geen verhoogd proliferatie-.
   gedrag i.vgl.m. de overige personen.
- In Grafiek IV.15 heeft nummer 75 (contr.) een verhoogde DI.
- In Grafiek IV.16 heeft nummer 27 een te lage DI i.vgl.m. de andere
   personen.


e)  Algemeen
------------

Indien men nu alle Grafieken (IV.1 t.e.m. IV.16) bekijkt en onderling
vergelijkt, kan men een aantal opvallende opmerkingen maken:

*  Indien men grafiek IV.2 (%CB versus Mono + MN, alcohol -S9) en
    Grafiek IV.3 (%CB versus Mono +MNCB, alcohol +S9) vergelijkt met
    respektievelijk Grafiek IV.6 (%CB versus MNCB, alcohol -S9) en
    Grafiek IV.7 (%CB versus MNCB, alcohol, +S9), kan men besluiten
    dat in het geval van alcohol-toevoeging het micronucleus-aantal
    over het algemeen bij de mononucleairen zeer klein is ten
    opzichte van de micronucleus-induktie bij de binucleairen.
*  Bij vergelijking van Grafiek IV.4 (%CB versus Mono + MN, cyclo)
    met IV.8( %CB versus MNCB, cyclo) valt op dat de micronucleus-
    induktie hoog is bij binucleairen en dat het micronucleus-aantal
    bij mononucleairen ('gemiddeld') zo goed als nul is.
*  Deze opmerkingen gelden uiteraard eveneens voor de Grafieken IV. 9
    t.e.m. IV.16, waarin de divisie-index (DI) uitgezet word op de
    y-as i.p.v. het percentage CB.


C. Apoptosis-detektie
---------------------

1) Tellingen
------------

Bij de apoptosis-detektie werden per persoon 4000 cellen geteld, waarbij
onderscheid werd gemaakt tussen apoptotische en niet-apoptotische cellen.
Wegens tijdsgebrek konden niet alle preparaten geteld worden, enkel de
onderstaande werden geanalyseerd. Op twee na (nl. 10 en 11) werden alle
CFS-patienten geteld. [zie Tabel IV.31]


Tabel IV.31 tellingen apoptosis-detektie
-------------------------------------------------------
code    typo        niet-       apopto-  % apoptotische
                     apopto-     tische   cellen
                     tische      cellen
                     cellen
-------------------------------------------------------
9       MS          3999        1        0.25
14      CFS         3979        21       5,25
28      CFS         3973        27       6,75
30      CFS         3978        22       5,50
36      CFS         3988        12       3,00
37      CFS         3974        26       6,50
38      CFS         3966        34       8,50
43      CFS         3987        13       3,25
27      controle    3976        24       6,00
35      controle    3991        9        2,25
------------------------------------------------------


2) ChI-kwadraat verwerking
--------------------------

De bedoeling was om de waarden van de apoptosis-detektie van elke CFS-patient
te vergelijken met de overeenkomstige waarden van, de 'matched' controle-
persoon. Doch, zoals reeds vermeld, werden slechts twee controle-personen
geanalyseerd. Daarom word enkel voor deze twee koppels de Chi-kwadraat test
toegepast zoals beschreven in [deel III.E.4].

   controle nr. 27/ CFS nr. 28 : p-waarde = 0,6725
   controle nr. 35/ CFS nr. 36 : p-waarde = 0,5107

3) Beschrijving
---------------

De 'matched' personen 27/28 hebben een p-waarde [zie bovenaan deel IV.C.2]
onder 0,05. Daarom kan men besluiten dat het verschil tussen beide personen,
wat betreft apoptostische cellen, niet signifikant verschillend is. Dit
geldt ook voor het koppel 35 (controle) en 36 (CFS). De overige waarden in
Tabel IV.32 voor CFS-patienten (nl. nummers 14, 30, 37, 38, 43) wijken niet
af van de (ongepubliceerde) waarden die gevonden werden in het labo voor
Antropogonetica. Op basis van de gegevens in Tabel IV.31 kan er geen
onderscheid gemaakt worden tussen CFS-patienten en controle-personen.



                             V.  DISCUSSIE
                             -------------

A. Vooropstellingen bij de proeven
----------------------------------

Om een algemeen beeld te krijgen van de celbiologische achtergrond van CFS,
werd de proliferatie snelheid en de efficientie van geprogrammeerde celdood
nagegaan in T-lymfocyten. Deze balans tussen celproliferatie en celdood
werd benaderd in vitro in geheel-bloed lymfocyten kulturen. Om de mogelijke
genetische predispositie - hetzij door mutatie, hetzij door het falen van
het repair-systeem - na te gaan bij CFS werd aanvullend de gevoeligheid voor
3 (pro-) mutagenen bestudeerd namelijk MMS (direkt mutagen), cyclofosfamide
(pro-mutagen) samen met een metabolische aktivator (59) of alcohol, al dan
niet in de aanwezigheid van S9. De technieken die gebruikt werden om deze
doelstellingen te benaderen, zijn de cyto-B geblokkeerde micronucleus test
en de TUNEL-test.

3. Experimentele beperkingen
----------------------------

1. Cyto-3 geblokkeerde in vitro micronucleus-test
-------------------------------------------------

1.1   Populatiegrootte:
-----------------------

In deze verhandeling werden 9 CFS-, 1 MS- (multiple sclerose),
1 fibromyalgie-patient en 11 controle-personen geanalyseerd. Dit is uiteraard
op epidemiologiech vlak een zeer kleine populatie. Daarom kan men hier
slechts spreken van tendensen.

1.2   Staalname-afhankelijkheid
--------------------------------

De bloedstalen van de CFS-patienten werden verkregen via Prof Dr De Meirleir
(dienst menselijke fysiologie, VUB), die ook de selektie van de patienten
verzorgde. De stalen werden geanalyseerd op gecodeerde preparaten, d.w.z.
het was bij de tellingen niet bekend welke de CFS-patienten of de controle-
personen waren. De combinatie van deze twee faktoren zorgde er voor dat,
buiten ons om, naast de CFS en controle-personen ook een MS- en een
fibromyalgie-patient werden geanalyseerd.

Deze 'staalname-afhankelijkheid' was er ook de oorzaak van dat alle kulturen
en behandelingen elkaar snel opvolgden, en er dus geen tijd was om de
analysen (tellingen) onmiddellijk uit te voeren. De preparaten werden voor
het grootste deel bewaard tot het tweede deel van het academiejaar. Vandaar
dat de experimenten niet konden herhaald worden indien er problemen opdoken,
zoals besmettingen, de MMS-concentratie, de matching van controles en
patienten,

1.3 Analyse is niet altijd mogelijk
-----------------------------------

Er werden in totaal vanaf het bloed van 37 personen kulturen aangemaakt.
Doch slechts 22 werden effektief geanalyseerd (geteld) in deze verhandeling.
Dit heeft verscheidene redenen. Vooreerst traden soms, ondanks het steriel
werken, besmettingen van de kulturen op. Deze waren merkbaar voor de
spreiding van de cellen op de preparaten. Hierdoor was heel soms een
volledige reeks van 1 persoon verloren. Soms echter waren deze besmettingen
slechts merkbaar bij de analyse van de preparaten. Hierdoor werd niet 1
volledige reeks, maar twee (ook de 'match') onbruikbaar. Zoals reeds gezegd
konden deze problemen immers niet opgelost worden door een persoon-reeks te
herhalen. Ook het aspekt tijd speelde een rol zodat uiteindelijk
11 patienten (o.a. 9 CFS) en 11 controle-personen geanalyseerd werden.

1.4 MMS concentratie
--------------------

Blijkbaar was de MMS-concentratie te toxisch voor vele van de controle-
personen en enkele van de CFS-patienten, de reden hiervoor is niet gekend.
Doch het was niet mogelijk dit probleem te ontdekken en misschien te
herstellen, vermits de analyse slechts gebeurde nadat alle kulturen
behandeld waren. De reden hiervoor werd reeds aangehaald in [deel V.B.1.2].

1.5 Bronnen van variatie
------------------------

Ten einde conclusies te trekken omtrent de resultaten van de cyto-B MN-test
bij CFS is het van essentieel belang om de grootte en de bron van variatie
in de resultaten in te schatten. Deze variatie kan essentieel opgedeeld
worden in technische variatie, intra-individuele variatie en inter-
individuele variatie.

Technische variatie - Om deze bron van variatie in te schatten wordt elk
bloedstaal in twee kulturen opgedeeld en in parallel, met identiek dezelfde
techniek verwerkt. Het tellen van de preparaten werd door twee personen
tegelijk uitgevoerd (elk een kultuur). Deze werkwijze brengt een bijkomende
bron van variatie daar deze personen de preparaten verschillend kunnen
interpreteren, ondanks de strikte criteria. Kleine verschillen in de
manipulaties kunnen ook aan de basis liggen van de variatie.

Intra-individuele variatie - Binnen eenzelfde bloedstaal bestaat een zekere
heterogeniteit, t.t.z. 'biologische' variatie, tussen cellen wat de
gevoeligheid betreft om schade te ontwikkelen of te prolifereren. Deze
biologische variatie kan veroorzaakt worden door variatie in samenstelling
van het bloed (verhoudingen tussen typen bloedcellen, subpopulaties in de
T-lymfocyten, enz...) naargelang het tijdstip van bloedafname, de
gezondheidstoestand, ... De huidige experimentele opzet laat echter niet
toe deze mogelijke bron van 'biologische' variatie in te schatten daar
gewerkt wordt met een enkel bloedstaal per persoon. Naast biologische
variatie binnen eenzelfde individu bestaat deze vorm van variatie uiteraard
tussen verschillende individuen.

Inter-individuele variatie - deze bron van variatie is te wijten aan het
feit dat elk individu een verschillende gevoeligheid heeft voor de
ontwikkeling van DNA schade en repair. We kunnen deze variatie als
'biologisch' beschouwen. Inter-individuele variatie kan evenwel ook van
technische aard zijn door het gebruik van verschillende batch produkten
(zoals S9, fytohaemagglutinine en FCS) bij verschillende patienten en door
verschillende interpretatie van de preparaten door de twee tellers.

1.6   Achtergrond-informatie van patienten en controle-personen
---------------------------------------------------------------

De achtergrond-informatie (zoals alcohol-gebruik, rookgewoonten,..) van vele
CFS-patienten en sommige controles was voorlopig niet beschikbaar. Daarom
werd besloten deze informatie niet in rekening te brengen bij de
interpretatie van de resultaten.

2. Apoptosis-detektie
---------------------

2.1   Besmette stalen
---------------------

De preparaten die gemaakt werden vanaf lymfocytenpellets waren besmet. Deze
stalen konden niet opnieuw verkregen worden [zie deel V.C.1.2], daarom werd
gekozen om de preparaten die beschikbaar waren te gebruiken, namelijk de
metafase-preparaten.

2.2   Onvolledige analyse
-------------------------

Wegens tijdsgebrek konden niet alle personen geanalyseerd worden in de
TUNEL-test. Doch voor de meeste CFS-patienten is dit wel het geval. Niet
alle 'matched' controle-personen werden geanalyseerd om dezelfde reden, doch
dit bleek geen hinderpaal te zijn vermits de apoptosis frekwentie zeer laag
lag bij alle CFS-patienten.

C. Bespreking van de resultaten
-------------------------------

Zoals reeds besproken, is het aantal personen, geanalyseerd in deze
verhandeling, veel te klein opdat men conclusies zou kunnen trekken. Vandaar
dat men beter van tendensen kan spreken.

1. Cyto-B geblokkeerde in vitro micronucleus-test

1.1   Inleiding
---------------

Bij deze test worden de kulturen gestimuleerd om te delen en daarna
behandeld met cytochalasine-B, een stof die op de actine bindt en daardoor
de cytakinesis blokkeert. De kernen delen zich dus, maar de cel niet. Na
1 celcyclus bekomt men dus cellen met twee kernen en eventueel 1 of meerdere
micronuclei. Een micronucleus ontstaat in een cel als bij de deling een
chromosoom of een chromosoomfragment afgezonderd geraakt van de spoelfiguur,
en niet meer geincorporeerd wordt in de dochtercellen.

De frekwentie aan meerkernige cellen geeft een schatting van het aantal
delende cellen; d.i. vooral nuttig omdat het een maat geeft voor
cytotoxiciteit of verandering in celproliferatie-kinetiek te wij een aan het
testprodukt of het verschil tussen CFS-patienten en controle-personen. Zo
kan men dus de proliferatie snelheid berekenen. Naast de proliferatiesnelheid
detekteert de test chromosoombreuken en aneuploidie. Aan de kulturen werd
alcohol, al dan niet met een metabolische aktivator (S9), MMS (direkt
mutagen) of cyclo (pra-mutagen) toegevoegd, om de gevoeligheid van de
T-Iymfocyten voor deze stoffen na te gaan.

Wanneer men het aantal micronuclei in monunuclcaire cellen (Mono + MN)
bekijkt, kan men conclusies trekken omtrent de spontane schade aanwezig
voor deling.

Wanneer men het aantal micronuclei in binucleaire cellen (MNCB) bekijkt, kan
men een idee hebben over de schade na deling. In controle kulturen zal het
aantal MNCB de spontane schade weergeven terwijl het aantal MNCB in
behandelde kulturen het gevolg zijn van geinduceerde schade.

1.2 Proliferatie
----------------

*  Is er een verschil in proliferatie snelheid van lymfocyten van
    CFS-patienten en deze van controle-personen in afwezigheid van
    een mutagen?

De proliferatie snelheid werd op verschillende manieren weergegeven (a.d.h.v.
grafieken, synthesetabel en gemiddelden). Uit de grafieken, noch uit de
synthesetabel kon een verschil gevonden worden in proliferatie tussen
CFS-patienten en controle-personen. Wanneer men echter het 'gemiddelde' van
de divisie-indices (gem.*) bekijkt, kan men zien dat de 'gemiddelde'
divisie-index bij CFS-patienten lichtjes lager ligt dan bij controle-
personen, in het geval van controle zonder S9. Doch het gebruik van deze
berekeningen geeft enkel een idee, men mag dit niet zien als een geldig
besluit.

Deze tendens werd teruggevonden in verschillende studies waarbij in vitro
een verlaagde lymfocytenproliferatie als reactie op mitogene stimulatie werd
aangetoond (Klimas et al., 1990;Straus et al, 1993; Lloyd et al., 1989;
Behan et al., 1985) . Klimas (et al., 1990) bekeek de proliferatieve respons
na stimulatie met phytohaemagglutinine en pokeweed mitogen en besloot dat
deze respons verlaagd was in de meeste patienten in vergelijking met deze
in normale controles. Straus (et al. 1993) bestudeerde 18 CFS-patienten die
voldeden aan de CDC criteria en 17 'matched' controle-personen a.d.h.v.
flow-cytometrie. Lymfocyten van CFS-patienten vertoonden een verlaagde
proliferatieve respons na stimulatie door phytohaemagglutinine,
concanavalin A en staphylococcal enterotoxin B. Bij een studie van Lloyd
(et al., 1989) werd geconcludeerd dat de lymphocyt respons voor PHA
signifikant lager was in CFS-patienten tegenover gezonde controles;
opgemerkt wordt dat dit echter een milde daling is en eerder wijst op
immune disfunctie dan een klinisch signifikante immunodeficientie. Hierbij
werden 100 CFS en 100 'matched' controles geanalyseerd. Behan (et al, 1985)
toonde een verlaagde respons voor PHA aan, doch niet de CDC maar de acute
PVCFS criteria werden gevolgd.

Daarentegen werd bij een studie van Gupta (et al, 1992) een in vitro
lymfocytenproliferatie snelheid als reaktie op mitogenen teruggevonden bij
CFS-patienten die volledig vergelijkbaar is met deze van controle-personen.
20 CFS (CDC-criteria) en 20 controles (matching volgens sexe en leeftijd)
werden geanalyseerd. Hierbij werd geen abnormaliteit gevonden van
mononucleaire celrespons voor PHA, concanavalin A of pokeweed mitogen,
behalve in twee patienten waar en verlaagde respons werd aangetroffen.

In de studie van Lloyd (et al., 1989) wordt ook gemeld dat lymfocyt
proliferatieve respons voor PHA gereduceerd is tijdens acute virale infektie.

*  Bij CFS-patienten wordt de celdeling na toevoeging van alcohol en in
    afwezigheid van S9 sterk onderdrukt. In aanwezigheid van alcohol,
    wordt de normale celdeling bij CFS-patienten pas na toevoeging van
    S9 hersteld, terwijl de controle-personen nagenoeg geen hinder
    ondervonden van de behandeling met alcohol.

Uit de synthesetabel IV.31 blijkt dat de CFS-patienten een hoger aantal
binucleairen hebben na toevoeging van S9 in vergelijking met de kulturen
zonder S9. Deze observatie wordt bevestigd wanneer men de gemiddelden (gem*)
van de divisie-indices bekijkt [deel 1.B.2. 1c]. De divisie-index van CFS-
patienten, in aanwezigheid van alcohol, herstelt zich naar een waarde
vergelijkbaar met deze van controle-personen, indien S9 aan het milieu wordt
toegevoegd. De divisie-index van de controle-personen ondervindt geen
invloed van de aan- of afwezigheid van S9 wanneer de kultuur met alcohol
wordt behandeld.

Deze waarnemingen doen het vermoeden rijzen dat de CFS-patienten een
verstoorde of verminderde afbraak van alcohol vertonen waardoor de cellen de
toxische invloed ondervinden. Wanneer men echter een enzyme-extract, in dit
geval S9, toevoegt dan wordt de alcohol afgebroken door dit extract en
ondervinden de cellen aldus geen toxische invloed meer waardoor de divisie-
index terug stijgt naar een waarde die vergelijkbaar is met deze van de
controle-personen. Deze voorlopige hypothese van een mogelijke verstoring in
het alcohol-metabolisme moet uiteraard nog veel uitvoeriger onderzocht
worden.

1.3 Spontane mutaties
---------------------

a) voor deling
--------------

*  Bij alcohol-toevoeging is geen signifikante schade (MN) waarneembaar
    in niet gedeelde cellen, noch bij CFS-patienten, noch bij
    controle-personen

Immers uit grafieken IV.2 (%CB versus Mano+MN,'alcohol,-S9') en IV3 (%CB
versus Mano+MN,'alcohol,+S9'), IV.6 (%CB versus MNCB,alcohol,-S9) en
IV.7 (%CB versus MNCB,alcohol,+S9') haalt men dat de micronucleus-
aanwezigheid bij mononucleairen zeer klein is in vergelijking met deze bij
binuclearen. Deze resultaten konden niet bevestigd worden door
literatuurgegevens daar er nog geen studies gemaakt werden omtrent spontane
mutaties bij T-lymfocyten in CFS-patienten.

na daling
---------

*  treedt meer spontane schade op bij deling bij CFS-patienten dan
    bij controle-personen

Uit grafiek IV.5 (%CB versus MNCB;'controle,-S9) weten we immers dat over
het algemeen de CFS-patienten een hogere micronucleus-induktie hebben dan
de controle-personen.

In de literatuur werden geen studies gemaakt omtrent spontane mutaties bij
T-lymfocyten in CFS-patienten.

1.4 Geinduceerde mutaties
-------------------------

*  Na toevoeging van alcohol, treedt schade op bij CFS-patienten in
    afwezigheid van S9. Wanneer S9 toegevoegd wordt aan de kultuur op
    het moment uan de behandeling, dan treedt deze schade niet op.

Uit grafieken IV.6 (%CB versus MNCB,'alcohol,-S9') en IV.7.(%CB versus MNCB,
alcohol,+S9) weten we immers dat de micronucleus-induktie bij CFS-patienten
veel groter is zonder S9 dan met S9. Deze waarneming ligt mee aan de basis
van de reeds beschreven hypothese [zie deel V.C.1.2] waarbij een verstoord
alkohol-metabolisme als mogelijke oorzaak van zowel de verlaagde divisie-
index als de verhoogde schade wordt aangehaald.

*  Cyclofosfamide veroorzaakt schade in delende cellen, en geen
    schade in niet-delende cellen, zowel in CFS-patienten als in
    controle-personen.

Uit grafieken IV.4 (%CB versus Mono+MN,'cyclo') en IV.8(%CB versus MNCB,
'cyclo') werd immers besloten dat de micronucleus-induktie bij binucleairen
groter is dan bij mononucleairen; bij deze laatste is de micronucleus-
induktie zelfs zo goed als nul.

In de literatuur werden geen studies gemaakt omtrent geinduceerde mutaties
bij T-lymfocyten in CFS-patienten.

1.5 MMS-resistentie
-------------------

*  CFS-patienten zijn blijkbaar resistenter tegen een behandeling met
    MMS dan controle-personen

Uit [deel IV.B.2. 1a] de gegevens blijkt dat bij vele kulturen van controle-
personen (14 /22) de cellen stuk waren. Dit is in tegenstelling met de
CFS-kulturen, waar de helft minder kulturen (7/22) te kampen hadden met een
blijkbaar te cytotoxische concentratie MMS. Een oorzaak voor deze schijnbare
resistentie kan gevonden worden enerzijds in een verminderde opname van MMS
door de lymfocyten van CFS-patienten t.o.v. deze van controle-personen, of
anderzijds door een snellere repair van de schade in CFS-patienten t.o.v.
controle-personen. Deze laatste hypothese impliceert dat de schade
veroorzaakt door MMS en deze door alcohol, door een ander repair systeem
wordt hersteld. Verder onderzoek zal meer klaarheid moeten brengen.

1.6 Besluit
-----------

Uit onze resultaten werd een kleine verlaging van de divisie-index van
CFS-patienten waargenomen, doch verder onderzoek zal uitsluitsel hierover
geven. Bij CFS-patienten wordt de celdeling na toevoeging van alcohol, in
afwezigheid van S9 sterk onderdrukt. In aanwezigheid van alcohol, wordt de
normale celdeling bij CFS-patienten pas na toevoeging van S9 hersteld,
terwijl de controle-personen nagenoeg geen hinder ondervonden van de
behandeling met alcohol.

Bij CFS-patienten treedt meer spontane schade op bij deling dan bij
controle-personen. Na alcohol-toevoeging is er geen signifikante genetische
schade (micronuclei) waarneembaar in niet gedeelde cellen, noch bij CFS-
patienten, noch bij controle-personen.

Na toevoeging van alcohol treedt schade op bij CFS-patienten in afwezigheid
van S9. Wanneer S9 toegevoegd wordt aan de kultuur op het moment van de
behandeling, dan treedt deze schade niet op. Een mogelijke verklaring
hiervoor is dat de enzymen van S9 alcohol afbreken, waardoor de mutagene
eigenschappen te niet worden gedaan.

Cyclofosfamide veroorzaakt schade in delende cellen, en geen schade in
niet-delende cellen, zowel bij CFS-patienten als bij controle-personen.

Blijkbaar zijn CFS-patienten resistenter voor MMS dan controle-personen.
Een mogelijke reden hiervoor kan gevonden worden in een verminderde
membraanpermeabiliteit waardoor MMS door CFS-patienten minder wordt
opgenomen dan door controle-personen. Een andere mogelijke verklaring van
dit verschil in schade kan gevonden worden in een snellere of efficientere
repair van de schade bij CFS-patienten dan bij controle-personen.

2. Apoptosis-detektie
---------------------

Apoptosis of geprogrammeerde celdood in T-lymfocyten werd nagegaan met de
TUNEL-detektie test.

*  Bij het vergelijken van CFS-patienten met controle-personen werd,
    wat betreft apoptosis in T-lymfocyten, geen verschil aangetroffen.

Dit blijkt duidelijk uit de gegevens in Tabel IV.3 1. Het aantal apoptotische
cellen overschrijdt nooit 9%. Deze waarde is een normale waarde voor
spontane induktie van apoptosis.

Men kan dus besluiten dat bij CFS-patienten men een normale apoptosis
frekwentie terugvindt.

D. Besluit : Balans.
--------------------

In deze verhandeling werd nagegaan of de proliferatie snelheid en
geprogrammeerde celdood in T-lymfocyten van CFS-patienten afwijkingen
vertoonden een opzichte van gezonde personen. Aanvullend werd de
gevoeligheid voor 3 (pm-) mutagenen (MMS, alcohol, cyclo) bestudeerd.

Enerzijds werd bij CFS-patienten geen afwijkende apoptosis frekwentie
waargenomen. Anderzijds wat betreft de proliferatie van T-lymfocyten wijzen
deze preliminaire gegevens, bekomen met de cyto-B MN-test, op een licht
verlaagde proliferatie bij CFS. Echter uitsluitsel hierover geven is nog
niet mogelijk. Na toevoeging van alcohol, wordt in afwezigheid van S9, de
celdeling onderdrukt bij CFS-patienten; de normale celdeling wordt hersteld
na toevoeging van S9. De mogelijke verklaring hiervoor werd reeds eerder
vermeld.

Er treedt meer spontane schade op bij deling bij CFS-patienten dan bij
controle-personen. Bij alcohol-toevoeging is geen signifikante schade
(micronuclei) waarneembaar in niet gedeelde cellen.

Bij toevoeging van alcohol treedt schade op bij CFS-patienten in afwezigheid
van S9. Wanneer S9 toegevoegd wordt aan de kultuur op het moment van de
behandeling, dan treedt deze schade niet op. Zeer waarschijnlijk inaktiveert
S9 de mutagene eigenschappen van alcohol bij CFS-patienten, waarschijnlijk
via afbraak van alcohol door S9 enzymen.

Wat betreft cyclofosfamide werd er geen verschil tussen CFS en
controle-personen gevonden.

Blijkbaar zijn CFS-patienten resistenter voor MMS dan controle-personen.
Dit verschil kan misschien te wijten zijn aan een verminderde
membraanpermeabiliteit voor MMS bij CFS. Men kan echter ook veronderstellen
dat bij CFS een efficienter repair-systeem aanwezig is.

B. Toekomstperspektieven
------------------------

Vermits in deze verhandeling slechts een klein aantal CFS-patienten (9)
werd geanalyseerd, kan men hier slechts spreken van tendensen. Opdat men
daadwerkelijk conclusies zou kunnen trekken omtrent celproliferatie,
celdood en de invloed van mutagenen bij CFS, is een grootschalerige
epidemiologische studie vereist.

Met de cyto B micronucleus-test kunnen slechts genoom- en chromosoom-
aberraties opgespoord worden. Om een beter beeld te krijgen van de
genetische achtergrond van CFS, kan ook het aspekt gen-mutatie onderzocht
worden a.d.h.v. de CFLP-techniek (Cleavage fragment length palymorfism).
Met name het RNase L dat betrokken is in de anti-virale biosynthetische weg
kan hiermee geanalyseerd worden op het bestaan van mutaties. Deze
biosynthetische weg is immers geaktiveerd in CFS.

Om een compleet beeld te krijgen van de aanwezigheid van eventuele
strukturele chromosoom- en genoomaberraties, kan ook een karyotype gemaakt
worden van CFS-patienten en de Chromosoomaberratie-test kan aangewend
worden.

We zagen dat MMS bij een groot deel van de controle-personen een toxiciteit
induceerde, in tegenstelling tot de CFS-patienten, waar deze zelfde
concentratie aan MMS in veel minder personen toxisch was. Daarom kan in de
toekomst gedacht worden om een dosis-respons curve op te stellen van MMS in
de cyto-B micronucleus-test. Ook kan een dosis-respons curve opgesteld
worden m.b.v. de Comet test, deze meet dubbelstrengige en enkelstrengige
breuken en detekteert eveneens alkali-labieke sites in het DNA.
De Comet-test kan men ook aanwenden om repair te bestuderen.


Referenties
-----------

ABBEY S., GARFINKEL P., The Chronic Fatigue Syndrome and depression: cause,
effect or covariate, Reviews of Inf. Dis., 1991, 13( suppi 1), S 73-83

ABLASHI D., Summary: viral studies of chronic fatigue syndrome,
Clin. Inf Dis., 1994, 18 (suppl 1), S 130-133

Ablashi DV, Summary: viral syudies of chronic fatigue syndrome 1994

Agut H, Aubin iT, A new virus : the human heweavirus 6, Rev Prat,
1994; 44:871-874

AHMED B, STEVENS JO,, Viral persistence, In: Field BN, Knipe DM,
eds. Virology. NY: RavenPress, 1990,241-65

Anderson's Pathology, ed. J.M. Kissane, Morby Company, Missouri, 1990

Aoki T, Usuda Y, Miyakosbi H, Tamura K, Herberman RB,
Low natural killer syndrome clinical and immunological features,
Nat Immun. Cell Growth Regul. 1987; 6: 116-28

ARCHARD L., BOWLES N., BEHAN P.O., ET AL, Postviral fatigue syndrome:
persistence of enterovirus RNA in muscle and elevated creatine kinase,
Journal of the royal society of medicine, 1988, 81, 326-329

Archard LC, Bowles NE, Behan P0, Bell EJ, Doyle D,
Post viral fatigue syndrome: persistence of enterovirus RNA in muscle
and elevated creatine kinase, J K Soc Med,1988:81:326-9

ARNOLD L C, RADDA 0 K, BORE P J, STYLES P, TAYLOR D J, , Excessive
intracellular acidosis of skelet al. muscle on exercise in a patient with
post-viral exhaustion fa tigue syndrome, lancet, 1984, i: 1376-9

BAKHEIT A., BEHAN R DINAN T., ET AL, Possible upregulation of hypothalamic
5-hydroxytryptamune receptors in patients with postviral fatigue syndrome,
BMJ, 1992, 304, 1010-2

BARKER E., FUJIMARA S., FADEM M., ET AL, Immunologic abnormalities
associated with chronic fatigue syndrome, Cliji. InC Dis., 1994,
18 (suppl 1), S 136-141

BAZELMANS E, VERCOULEN IHHM, SWANINK CMA ET AL, Prevalentie van het
Chronisch Vermoeidheidssyndroom en het Primair Fibromyalgie Syndroom in
Nederland, Nederlands tijdschrifi voor de geneeskunde, 1996, ? geaccepteerd

BEHAN P0, BEHAN WHM, BELL E J, , The postviral fatigue syndrome-an analysis
of the findings in 50 cases, J infect, 1985, 10:211-22

Behan, P0, Behan WM, Bell U, The postviral fatigue syndrome-an analysis of
the findings in 50 cases, J; Infect., 1985; 10:211-22

BENSING JM, SCHREURS K, Sekseverschiflen bij moeheid, Huisarts en
Wetenschap, 1995, 38:412-421

Bleijenberg 0, Fennis IF, Galama JM, Enteroviruse and the chronic fatigue
syndrome, Clin Infect Dis, 1994; 19: 860-SM

BORYSIEWICZ LK, HAWORTH SJ, COHEN J, MUNDIN I, RICKINSON A,
SISSONS JOP,, EBV-specific immune defects in patients with persistent
symptoms following infectieus mononucleosis,
Q J Med, 1986, 58(new):111-21

Bowles NE, et ,Persistence of enterovirus RNA in muscle,
J Med, 1993; 24:145-160

Buchwald D, Cheney PR, Peterson DL, et al, A chronic illness characterized
by fatigue, neurologic and immunologic disorders, and active human
herpesvirus type 6 infectien, Ann Intern Med, 1992; 116:103-13

Buchwald D, Komaroff AL, Review of laboratory findings for patients with
chronic fatigue syndrome, Rev. Infect. Dis., 1991; 13(suppl 1): S 12-8

CALIGIURI M, MURRAY C, BUCHWALD D, LEVINE H, CHENEY P. PETERSON
D, KOMAROFF A L, RITZ J, Phenotypic and functional deficiency of natural
killer cells in patients with chronic fatigue syndrome,
J immunol, 1987, 139:3306-13

CARPMAN V, A urine test fos CFIDS ?- Aastralian research may be a major
breaktrough, The CFIDS Chronicle, 1996, pp 5-61, summer

Centers for Disease Controle and Prevention, Inability of retroviral tests
te identify persons with chronic fatigue syndrome, 1993; MMWR

CEUPPENS ET AL, Apoptosis in humane pathologic, Tijdschrift voor
geneeskunde, 1996, blz 52, nol4-15

CEUPPENS,,, 1996,

CHAO C C, JANOFF E N, HU S X, THOMAS K, GALLAGHER 14, TSANG M, PETERSON P K,
Altered cytokine release in peripheral blood mononuclear cell cultures
from patients with the chronic fatigue syndrome, Cytokine, 1991, 3:292-S

CHENEY ET AL, Interleukin-2 and the chronic fatigue syndrome,
Ann Of Intern Med, 1989, 110,231

Clements (IB, McGarry F, Nairn C, Detection of enterovirus-specific RNA in
serum: the relationship to CFS,1995;J of Medical Virology,
vol 45, no 2, 156-161

COHEN S, TYRELL DAJ, SMITH ALP, Psychological stress and susceptibility to
the common cold, New Engl J, 1991, 325:606-12

COHEN SS, Antiretroviral therapy for AIDS, New Engl J Med, 1988, 317, 629

CORCORAN GB, LF, JONES DP, MOSLEN MT, NICOTERA P, OBERHAMMER F,
BLYITYAN R, Cantemporary issue intoxicology. Apoptosis : molecular controle
point in toxicity, Toxicology and applied pharmacology, 1994, 128,169-18 1

Cunningham L, Bowles NE, Lane RJ, Dubowitz V, Archard LC, Persistence of
enteroviral RNA in chronic fatigue syndrome is associated with the abnormal
production of equal amounts of positive and neagtive strands of enteroviral
RNA J Gen Virol, 1990; 71:1399-402

David S, Wesseley S, Pelosia J, Postviral fatigue syndromme : time for a
new approach, 1988,296:696-9

Davis BD, Dulbecco R, Eisen HN, Ginsberg HS, Microbiology 1990 4th edition,
ed.Lippincolt Company, Philadelphia, USA

DE BOECK M, KIRSCH-VOLDERS M, Neireis virens als bioindikator voor
genetische schade geiduceerd door PAK's, Licentiaatsverhanddling
biologie VUB, 1996,

DEFREITAS E, HILLIARD B, CHENEY P R, ET AL, Retroviral sequences in
patients with posiviral fatigue syndrome, Proc Natl Acad Sci USA,
1991, 88:29224

DeFreitas E, Hilliard B, Cheney P, et 4 Retroviral sequences related to
HTLV II in patients with chronic fatigue immune dysfunction syndrome,
Proc Natl Acad Sci, 1991; 88:2922-6

DEMITRACK MA, DALE J K, STAUS S E, LAUE L, LISTWAK S J, KRUESI MW
ET AL, Evidence for impaired activation of the hypothalainic-hypopituaiy-
adrenai axis in patients with chronic fatigue syndrome,
J Clin Endocrinol Metab, 1991, 73:1224-34

DOWSETT EG, RAMSAY AI4, MCCARTNEY RA, BELL El, Myalgic Encephalomyelitis-
a persistent enteroviral infectien?, postgraduate medical journal,
1990, 66,526-530

Dubois RE, Seeley JK, Brus I, et al Chronic mononucleosis syndrome,
South Med J, 1984; 77:1376-82

DUKE,,, 1996,

EDWARDS R HT , NEWHAM D J, PETERS T J , Muscle biochemistry and
pathophysiology in postviral fatigue syndrome,
Br Med Bull, 1991, 47:826-37

ELHAJOUJI A., SANTOS A.P., VAN HUMMELEN P., KIRSCH-VOLDERS M.,
Metabolic differences between whole blood and isolated lymphocyte cultures
for micronucleus (MN) induction by cyclophosphamide and benzo[a)pyrene,
Mutagenesis, 1994, vol 9, no4, pp 307-313

ELHAJOUJI K, TIBALDO F, KIRSCH-VOLDERS M, Indication for tresholds of
chromosome non-disjunction versus chromosome lagging induced by spindle
inhibitors in vitro in human lymphocytes,
Mutagenesis,1997, voll2, no3, pp 133-140

ELBAJOUJI A., VAN HUMN{ELEN P , KIRSCH-VOLDERS M., Indication for a
treshnid of chemically induced aneuploidy in vitro in human lymphocytes,
Environmental Mutagenesis, 1195,26: 292-304

ELLIS, Uit: doctoraatsverhandeling Berlunda Verdoodt,, 1991, In press

EVAN CI, WYLLIE CS, GILBERT CS, LITWEWOOD TD, LAND H, BROOKS 14,
WATERS 12, PENN CM, HANCOCK DC, Induction of apoptosis in fibroblasts
by c-myc protein, Cell, 1992, 69: 119

FENECH EN MORLEY, Solutions to the kinetic problem in the micronucleus
assay, Cytobios., 1985, 43, 223-246

FIEDLER N, KIPERN H, NATELSON B, OTTENWEILER I, Chemical sensitivities
and the Gulf War: departetnent of veterans afibirs research center in basic
and clinical science Studies of environmental hazards, Regulatory
Toxicology and Pharmacology, 1996, 24, 5129-5138

FRANKS EN TEICH, Introduction to the cellular and molecular biology of
cancer, second edition, ed. Oxford medical publications,, 1993,

FRITSCHE M, HAESSLER C, BRADNER 0, Induction of nuclear accumulation of the
tumour suppressor gene p53 by DNA damaging agents,
Oncogene, 1993, 8:307-3 18

FUKUDA, STRAUS, HICKIE, ET AL, The CFS: a comprehensive approach to its
definition and study, Ann of Intern Med, 1994, volume 121; number 12;
pages 953-959

Galama JMD, Melchers WIG, Jongen PJH, heessen FWA, Van Der meer JWM~,
Persisteanie van enterovirussen; een verband met chronische aandoeningen?,
Ned Tijdschrift Geneeskd, 1991;135, nr 43

GAVRIELI,,, 1992,

GERSCHENSON LE, ROTELLO RI, LIEBERMAN R, SZE CI, Apoptosis: defenition
and regulation, The cell-cycle: Regulators, Targets and clinical
applications, ed Plenum Press, NY, 1994, Hft 34, pp 291-299

Giller en Grose, EBV the hematologie and oncologie consequences of virus-
host interaction, Critical Reviews in Oncology/Hematology 1989; vol 9,
issue 2, 149 -195

GIN W, CHRISTIANSEN F T, PETER J B, Immune function and the chronic fatigue
syndrome, Med J Aus, 1989,151:117-8

Gow JW et al, Amplification and identification of enteroviral sequences in
the postviral fatigue syndrome, Br Med Bull, 1991b; 47, 872-8 5

Gow .JW, Behan WMH, Clenients GB, Woodall C, Riding M, Behan P0,
Enteroviral RNA sequences detected by polymerase chain reaction in muscle
of patients with post-viral fatigue syndrome, BMJ, 1991a; 302:629-6

Gow SW, Behan WMH, Simpson K, McCarty F, keir 5, Behan P0, Studies on
enterovirus in patients with chronic fatigue syndrome, Clin Infect Dis,
1994; 18(suppll):S126-9

Gow SW, Simpson K, Schilephake A, et al, search for retrovirus in the
chronic fatigue syndrome, J Clin Pathol, 1992;45; 1058-61

GUILLOUF C, ROSSELLI F, KRISHNARAJU K, MOUSTACCHI E, HOFFMAN B,
LIEBERMAN DA, p53 involvement in control of G2 exit of the cell cycle:
role in DNA damage-induced apoptosis, Oncogene, 1995, 10, 2263-2270

GUPTA S, Recent developments in immunological aspects of CFS,
In: The clinical and scientific basis of myalgic Encephalomyelitis/chronic
fatigue syndrome, Hyde, Goldstein,

Levine, ed. The Nightingale Research Foundation, 1992, 545-5 50

Gupta S, Vayuvegula BA, Comprehnsive immunological analysis in chronic
fatigue syndrome, Scand J Immunol,, 1991; 28: 1403-10

HAINAUT P, The tumor suppressor protein p53 : a receptor to genotoxic
stress that controls cell growth and survival, Current Opinion in
Oncology, 1995,7:76-82

HENEINEW, WOODS TC, SINHA SD,KHAN AS, CHAPMAN LE, FOLKS TM
Lack of evidence for infectien of known human and animal retroviruses in
patients with chronic fatigue syndrome,
Clin Infect Dis, 1994, 18 (suppl l):s: 121-5

Heneine W, Woods TC, Sinha SD, et al, Lack of evidence for infection with
known human and animal retroviruses in patients with chronic fatigue
syndrome, Clin Infect Dis, 1994;l8(suppl 1):S121-5

HICKIE I, LLOYD A, WAKEFIELD G,, The psychiatric status of patients with
the chronic fatigue syndrome, Br Medi, 1990, 156:543-40

Hilgers A, Krueger GRF, Lembke U, Ramon A, Post-infectieus chronic fatigue
syndrome: case history of thirthy-five patients in Germany,
In Vivo,1991; 5:201-6

HINDS EN MCCLUSKEY, A retrospective study of the chronic fatigue syndrome,
proceedings of the royal college of physicians of Edinburgh,
1993,23,10-14

HO-YEN A R, MCNAMARA I, General practitioners' experience of the chronic
fatigue syndrome, Br J Gen Pract, 1991, 1991b;41:324-6

HO-YEN DO, CARRINOTON D, ARMSTRONG AA, Myalgic encephalomyditis and
alpha-interferon, lancet, 1988, i:125

HOLMES OP , KAPLAN, GANTZ, CFS : A working case definition,
Annals of internal medicine, 1988, 108,387-389

Holmes GP, Kaplan SE, Stewart JA, Hunt B, Pinsky PF, Schonberger LB,
A cluster of patients with a chronic mononucleosis-like syndrome:
is EBV the cause ?, JAMA 1987, 257: 2297-302

HOLMES, KAPLAN, STEWART, PINSKY, LAWRENCE, SCHONBERCIER, A cluster of
patients with a chronic mononucleosis-like syndrome- Is EBV the cause?,
JAMA, ,vol 257, no 17, blz 2297-2301

HOVANESSIAN AG, Interferons : direct effects upon viral replication,
In: Approaches to antiviral agents, ed Harnden, Macmillan London,
1985, pp 217-260

HYDE B, The search for a retrovirus in ME/CFS.
A review, In: The clinical and scientific basis of ME/CFS,
Hyde, Goldstein , Levine, 1992, 330-329

JACKS EN WEINBERG, Cell -cycle controle and its watchman,
Nature, 1996, vol 381, 20 june

JONES IF, RAY C R, MINNICH LL, HICKS MI, LUCAS D 0, Evidence for active
Epstein-Bar virus infectien in patients with persistent unexplained
illnesses: elevated anti-early antigen antibodies,
Ann Intern Med, 1985, 102:1-7

JONES JF, STRAUS SE, Chronic EBV infectien,
Ann Rev Med, 1987, 38:195-209

Jones JF, Ray CG, Minnich LL, Hick MI, Kibler R, Lucas DO,
Evidence for active-EBV-infectien in patients with persistent,
unexplained illnesses: Elevated anti-early antigen antibodies,
Ann Int. Med, 102, 1, 1985

JOSEPHS S F, HENRY B, BALACHANDRAN N, STAYER D, PETERSON D,
KOMAROFF A L, ABLASHI D V, , HHV-6 reactivation in chronic fatigue syndrome,
Lancet, 1991,337:1346-7

JOSEPHS SC AND THE COMPREHENSIVE CLINICAL EVALUATION PROGRAM EVALUATION TEAM,
A comprehensive clinical evaluation of 20000 Persian Gulf War veterans,
Military Medicine, 1997, vol 162, march

Josephs, SF, Henry B, Balachandran N, et al, HHV-6 reactivation in chronic
fatigue syndrome, Lancet,1991;337:1346.-7

KASTAN MB, ONYEKWERE 0, SIDRANSKY D, VOGELSTEIN B, GRAIG RW,
Participation of p53 protein in the cellular respons to DNA damage,
Cancer Ret, 1991, 51:6304-6311

KENDELL RE, Chronic fatigue, viruses ,and depression,
Lancet, 1991, 337:160-2

KENNETH CLI, WIGNALL FS, War syndromes and their evaluation;
From the US civil war tot the Persian Gulf War,
Annals of Internal Medicine, 1996, vol 125, no 5

KERR JFR, WYLLIE All, CURRIE AR,, Br J Cance, 1972, 26,239-257

Khan AS, Heneine WM, Chapman LE, et al,
Assessment of a retrovinas sequence and other possible risk factors for
the chronic fatigue syndrome in adults, 1993; 118:241-5

KLIMAS NG, SALVATO FR, MORGAN R, FLETCHER MA, Immunologic abnoramlities in
CFS, S Clin Microbiol, 1990, 28:1403-10

Klimas NG, Salvato FR, Morgan R, Fletcher RA, Immunologic abnormalities
in chronic fatigue syndrome, S. Clin. Microbiol, 1990; 28:1403-10

KO LJ EN PRIVES C, p53 : puzzle en paradigm,
Genes and development, 1996, 10: 1054-1072

KOMAROFF A L, , Chronic fatigue syndromes : relationship to chronic viral
infectien, J Virol Methods, 1988, 21:3-10

Krueger, GRF, Koch B, Ramon A, et al,
Antibody prevalence to HBLV (human herpes virus-6, HHV-6) and suggestive
pathogenicity in the general population and in patients with immune
deficiency syndromes, J. Virol. Methods, 1988,21:125-31

KUERBITZ SJ, PLUNKETT BS, WALSH WV, KASTAN MB, Wild-type p53 is a cell-
cyle checkpoint determinant ofollowing irradiation,
Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:7491-7495

LANDAY AL,JESSOP C,LENNETTE E T, LEVY J A, CFS: clinical condition
associated with immune activation, Lancet, 1991, 338: 707-12

Landay AL, Jessop C Lennette ET, Levy LA, Chronic fatigue syndrome:
clinical condition associated with immune activation,
Lancet, 1991; 338 : 707-12

LANE D, p53, guardian of the genome, Nature, 1992, 278:261-263

LENGYEL P, Biochemistry of inteaferons and their action,
Annu Rev Biochem. , 1982, 51:25 1-82

LEVER AML, LEWIS DM, BANNISTER BA, FRY M, BERRY N, Interferon
production in postviral fatigue syndrome, Lancet, 1988, ii: 101

LEVINE AS EN MOMAND J, Tumour suppressor genes-the p53and retinoblastoma
sensitivity genes and gene products,
Biochem. Biophys. Acta, 1990, 1032:119-136

LEVINE AJ,MOMAND J, FINLAY CA, The tumour supprssor gene p53, Nature,
1991,351,453-456

LEVINE ARNOLD J. , Tumor suppressor genes, Scientific American / Science
and Medicine, 1995, jan/febr 1995, pp 28-37

Levine en Komaroff, HHV-6 and chronic fatigue syndrome (letter);
Arch Intern Med, 1993; 153; 661

LEVY I A,, Viral studies of chronic fatigue syndrome: Introduction,
Clin Infect Dis, 1994, 18(suppl 1): 5:117-20

LIEBERMAN EN BELL, Serum angiotensin-converting enzyme as a marker for the
chronic fatigue immune dysfUnction syndrome: a comparison to serum
angiotenain-converting enzymes sarcoidosis, Am J Med, 1993, 95:407-412

LLOYD A R, HICKIE I, BOUGHION C R, SPENCER 0, WAKEFIELD D,
Prevalence of chronic fatigue syndrome in an Australian population,
Med J Aust, 1990, 153:522-S

LLOYD AR, WAKEFIELD D, BOUCUTON C K, DWYER J M, Immunologic abnormalities
in the chronic fatigue syndrome, MED J AUST, 1989, 151: 122-4

LLOYD A, Immunological abnormalities in patients with chronic fatigue
syndrome, In: The clinical and scientific basis of myalgic
encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome, Hyde, Goldstein, Levine, ed.
The Nightingale Research Foundation, 1992, 54 1-543

LLOYD ET AL, Cytokine levels in serum and cerebro spinal fluid for patients
with chronic fatigue syndrome and control subjects,
J Infect Dis, 1991, 164:1023-1024

Lloyd AR et al.., What is myalgic encephalomyelitis? ,
Lancet, 1988, i, 1286-1287

Lusso P, Malnati MS, gaizino-Demo A, Crowley BAY, Long EO, Gab RC,
infectien of natural killer cells by HHV-6, Nature, 1993; 362:458-62

Malzman W en Czyzyk L, UV irradiation stimulates levels of p53cellular
tumour antigenun nontransformed mouse cells,
MOL CELL BIOL, 1984, 54:1689-1694

MANU P, MAITHEWS D A, LANE T J , Depression among patient with a chief
complaint of chronic fatigue, I Affective Disorders, 1989, 17:165-72

MARGINSON EN O'CONNOR, Biological consequences of reactions with DNA,
Chemical Carcunogenesis and Mutagenesis,1990, mis Cooper C.S. en Grover
P.L., Springer Verlag; hftt. 14, pp 547-566

McArdle A, McArdle F, Jackson MJ, Page SF, Edwards RH, Investigation by
polymerase chain reaction in patients with chronic fatigue syndrome,
Clin Sci,, 1996; 295-300

MCDONALD EM ET AL, Interferons as mediators of psychiatric morbidity,
Lancet, 1987, ii,1175-117S

MEIJMAN IT, Over vermoeidheid, Amsterdam: studiecentrum Arbeid en
gezondheidlCoronel Laboratorium, Universiteit Amsterdam, 1995,

MICHEL I, NORBACK D, EDLING C, An epidemiologic study of the relation
between symptoms of fatigue, dental amalgam and other factors,
Swed Denti, 1989, 13:33-8

MILLER G, CROGAN E, ROWED, ET AL, Selective lack of antibody to a
component of ED nuclear antigen in patients with active Epstein-Barr virus
infectien, J Infect dis, 1987, 156:26-35

Miller NA, Carmichael HA, Hall FC, et al Antibody to Coxsackie B virus in
diagnosing postviral fatigue syndrome, Br, Med J, 1991;302: 140-3

NAGATA EN GOLDSTEIN, Uit: doctoraatsverhandeling Berlinda Verdoodt,, 1995,
In press

Natelson, High titus of anti-EBV DNA polymerase found in patients with
severe fatiguing illness, J of medical Virology, 1994,42,42-46

NILSEN TW, MAARONEY PA, ROBERTSON lID, BAGLIONI C, Heterogenous
RNA promotes synthesis of(2'5'A) and is cleave dby the (2'5')A-activated
andoribonuclease, Cell Biol, 1982, 2;154-160

PALARDY J, HAVRANKOVA I, LEPACE R ET AL, Blood glucose measurerments
during symptomatic episodes in patients with suspected postprandial
hypoglycemia. N Engl J Med, 1989, 321:1421-5

Palca J, Does a retrovirus explain fatigue syndrome puzzle?,
Science, 1990, vol 249:1240-1241

PAULESRS, LEVEDAKAI EN, WILSON SI, INNES CL, RHODES N, TLSTY TD,
GALLOWAY DA, DONEHAVER LA, Defective G2 checkpoint fUnction in cells from
individuals with familial cancer syndromes,
Cancer Res, 1995, 55, 1763-1773

RAY C, Interpreting the role of depression in chronic fatigue syndrome,
JENKINS R, MOWBRAY R, EDS. POSTVIRAL fatigue syndrome; Chichester:
John +Wiley & sons, 1991, 93-112

RILEY MS, O'BRIEN C J, MCCLUSKEY D R, BELL N P, , Aerobic work capacity in
patients with chronic fatigue syndrome, Br Med 1, 1990, 301:953-6

RUTHERFORD MN, HANNIGAN GE, WILLIAMS BRG, Interferon-induced bindig of
nuclear factors to promotor elements of the 2'5'A synthetase gene,
EMBO J, 1988, 7, 75 1-759

SHAFRAN S D, , The chronic fatigue syndrome, Am J Med, 1991, 90:730-9

SHARPE MC et al, A report- chronic fatigue syndrome: guidelines for
research, journal of the royal society of medicine, 1991, 84,118-121

SHEPHERD, CFIDS team, Richtlijnen voor de verzorging van CFS-patienten,
Vertaald en bewerkt met toestemming: Nw: ME brochure, Shepherd,
sec ed, 1995,

SHRODER HC, SUHADOLNIK RJ, PELEIDERER W, CHARUBALA R, MULLER WEG,
(2'-5')OLifoadenylate and intracellular immunity against retrovirus
infectien, Int J Biochem, 1992, vol 24, no 1, pp 55-63

SISTO, LAMANCA ET AL, Metabolic and cardiovascular effects of a progressive
exercise test in patients with CFS,
The American J of Med, 1996, vol 100, june 1996, blz 634-640

SMETSEMA, GARS SEN B, BONKE B ET AL, The multidimensional fatigue inventory
(MFI). Psychometric qulities of an instrument to asses fatigue,
J of Psychosomatic research, 1995, 39:315-325

SOUSSIE T, The p53 tumour suppresoor gene: from molecular biology to
clinical investigation, Cellular genetics of cancer, chapter 7, 1995,

SOUTHERN P, OLDSTONE MBA, Medical consequences of persistent viral
infectien, N Engl J Med, 1986, 314:359-67

STEIN M, KELLER S E, SCHLEIFFER S I, Stress and immunomodulation :
the role of depression and neuroendocrien fUnction,
J Immunol, 1985, 135:827-33

STEWART N, HICKS CC, PARASKWAS F, MOWAT M, Evidence for a second ceel-cyle
block at G2/M by p53, Oncogene, 1995, 10,109-119

STOKES M J, COOPER R G, EDWARDS RHT, Normal muscle straight and
fatigability in patients with effort syndromes,
Br Med J, 1988, 297: 1014-7

STRAUS SE, DALE JK, PETER IB, DINARELLO CA, Circulating lymfokine levels in
the chronic fatigue syndrome, J Infect Dis, 1989, 160:1085-6

STRAUS SE, SCOTT F, DALE 1K, GOULD B, STROBER W, Lymphocyte phenotype
and function in the chronic fatigue syndrome,
J of Clinical Immunology, 1993, vol 13, no 1, pp 30-40

STRAUS SE, TOSATO 0, ARMSTRONG 0, ET AL, Persisting illness and fatigue in
adults with evidence of Epstein-Barr virus infection,
Ann Intern Med, 1985, 102:7-16

STRAUS, The chronic mononucleosis syndrome,
The Journal of infectieus diseases,
1988, vol 157, no 3, mutt 1988, blz 405- 412

Straus, The chronic mononucleosis syndrome, I
J infect Dis,1988; vol 157, no 3, maart 88, blz 405-412

STRAYER, CARTER, ET AL , Long term improvements in patients with chronic
fatigue syndrome treated with Ampligen, Journal of chronic fatigue
syndrome, 1995, vol 1(1), blz 35-53 0

STRAYER DR, CARTERWA, BRODSKY I ET AL, A controlled clinical trial with a
specifically configured RNA drug, polyQ):poly(C12U), in CFS,
Clin Infect Dis, 1994, 18(suppl):588-95

SUHADOLNIK R J, REICHENBACH N L, HITZGES P, ADELSON ME,
PETERSON D L, CHENEY F, SALVATO P, THOMPSON C, LOVELESS 14,
MULLER W E, Changes in the 2-5 A synthetase /RNase L antiviral pathway in
a controlled clinical trial with poly(i)-poly(C12U) in chronic fatigue
syndrome, In vivo, 1994, 1994b;8:599-604

SUHADOLNIK RJ, KARIKO K, REICHENBACH RW, SOBOL, ET AL,,
Biochemistry, 1993, in press

SUHADOLNIK RJ, PETERSON DL, O'BRIEN K, CHENEY PR, HERST CVT,
REICHENBACH NL, NING K, HORVATH SE, LACONO KT, ANDELSON ME, DE
MEIRELEIR K, DE BECKER P, CHARUBALA K, PFLEIDERER W,
Biochemical evidence for a novel low molecular weight 2-5A-dependent
RNase L in CFS, J of Interferon and cytokine research, 1997, 17:377-385

SUHADOLNIK, REICHENBACH, HITZGES, Upregulation of the 2-5 synthetase/
RNase L antiviral pathway associated with CFS,
Clinical Inf Dis, 1994, 1994a;18 (suppl 1): 596-104

SWANINK, Lymphocyte subsets, apoptosis, and cytokines in patients with CFS,
J Infect Dis, 1996, 173(2):460-463

Tobi M, Marag A, Ravid Z, Prolonged atypical illness associated with
serological evidence of persistent EBV-infectien, Lancet 1982;1 61-4

TOSATO, STRAUS, HENLE, PIKE, BLAESE, Characteristic T cell dysfunction in
patients with chronic active Epstein-Ban virus infectien ( chronic
infectieus mononucleosis ) , The Journal Of Immunology, 1985,
vol 134, no 5, blz 3082-3088

TRAUTH EN KEESEY, BOEHRINGER, TUNEL-TEST PROTOKOL,, 1996,

VAN HUMMELEN EN KIRSCH-VOLDERS, An improved method for the in vitro
micronucleus test on human lymphocytes, Mutagensis, 1990, 5 : 203-204

VAN HUMMELEN P., doctoraatsverhandeling VUB: evaluation of the micronucleus
assay for the identification of aneuploidy agents and human risk assesment
of exposure to carcinogens, 1994

VERCOULEN JHM, SWANINK CMA, FENNIS JFM, GALAMA JMD, VAN DE MEER JWM,
BLEIJENBERO G, Dimensional assesment of chronic fatigue syndrome,
J Psychosom Res, 1994, 38383-92

VERCOULEN JHM, SWANINK CMA, GALAMA JMD, FENNIS JFM, VAN DER MEER JWM,
BLEIJENBERG G , Het chronisch vermoeidheidssyndroom ii.
Psychosociale hypothesen, Ned Tijdschrift, 1991, 135:2010-4

Wakefield D, Lloyd A, Dweyer, Salahuddin SZ, Ablashi DV, HKV-6 and myalgic
encephalomyelitis, Lancet, 1988; i;1059

WESSELEY S, POWELL R, Fatigue syndromes: a comparison of chronic
'post-viral' fatigue with neuromuscular and affective disorders,
J Neural Neurosurg Psyciatry, 1989, 52:940-8

Wolf et al, Epstein-Br virus and its interaction with he host,
Intervirology, 1993, 35: 26-39

WYLLIE EN DUVALL,,, 1992,

Yalcin S, Kuratsune H, Yamaguchi K, Kitani T, Yamanishi, Prevalence of
human herpesvirus 6 variants A and B in patients with chronic fatigue
syndrome, Microbiological Immunology, 1994; 38:587-590

YOUSEF GE, BELL E J, MANN OF, ET AL, Chronic enterovirus infectien in
patients with postviral fatigue syndrome, Lancet, 1988, i: 146-150

Yousef GE, Bell ES, Mann (IF, et al, Chronic enterovinxs infectien in
patients with post-viral fatigue syndrome, Lancet, 1988;1:146-50

  Ga terug